CHANGES OF THE IMMUNOHISTOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF NEURONS OF THE MIDDLE GROUP OF THE HYPOTHALAMIC NUCLEI DURING AGING

Full Text

Введение. Гипоталамус - филогенетически старый отдел промежуточного мозга, который играет важную роль в поддержании постоянства внутренней среды и обеспечении интеграции функций автономной, эндокринной, соматической систем. Есть предположение об участии гипоталамуса в механизмах старения, при этом важная роль отводится вентромедиальному (ВМЯ) и дорсомедиальному (ДМЯ) ядрам гипоталамуса [12, 14]. ВМЯ и ДМЯ участвуют в регуляции трофики и поддержании энергетического гомеостаза, а также в контроле периферических циркадианных ритмов [11]. К числу важнейших ядер промежуточной гипоталамической области, участвующих в поддержании гомеостаза, относится и дугообразное ядро (ДЯ) [12]. В процессе возрастного развития изменяются цитохимические характеристики нейронов центральной и периферической нервной системы. В частности, происходят изменения содержания кальций-связывающих белков кальбиндина (КБ) и кальретинина (КР), нейропептидов, в том числе нейропептида Y (НПY), а также синтазы оксида азота (nNOS) [1, 8]. При старении происходят изменения экспрессии различных гипоталамических нейротрансмиттеров и гормонов [7]. Имеются сравнительно мало данных относительно нейрохимических особенностей гипоталамических нейронов при старении. Цель исследования - выявление изменений иммуногистохимических характеристик нейронов дугообразного, вентромедиального и дорсомедиального ядер гипоталамуса у крыс при старении. Материал и методы. Работа выполнена на крысах-самцах линии Вистар в возрасте 3-4 мес и 24-30 мес (по 5 животных в каждой группе). Исследование проводилось с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 775 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). На проведение исследования получено разрешение этического комитета Ярославского государственного медицинского университета (№ 29 от 21.02.2019 г.). После введения летальной дозы уретана (3 г/кг внутрибрюшинно) животных перфузировали транскардиально раствором стандартного фоcфатно-cолевого буфеpа (PBS, 0,01М, pH 7,4) (БиолоТ, Россия), затем 4 % pаcтвоpом паpафоpмальдегида (Sigma, США) на PBS. После перфузии головной мозг извлекали и иссекали участок гипоталамуса, содержащий ДЯ, ВМЯ и ДМЯ согласно координатам атласа мозга крыс [10], после чего помещали в ту же фиксирующую смесь, в которой производили перфузию, на 1-2 ч. Серии срезов толщиной 12 мкм изготовляли на криостате. Для выявления нейронов, содержащих nNOS, использовали первичные антитела козы (Abcam, США) в разведении 1:300. Для идентификации КБ, КР и НПY применяли антитела кролика (Abcam, США) в разведении 1:500, 1:100 и 1:500 соответственно. Вторичные антитела осла против козы или кролика были конъюгированы с флюорохромом флюоресцеин-изотиоцианатом (FITC, Jackson Immunoresearch, США) в разведении 1:100, дающим зеленую флюоресценцию. Негативный контроль проводили с отсутствием первичных или вторичных антител. Для расчета доли иммунопозитивных нейронов производили мечение всей нейронной популяции красителем Neuro Trace Red, (Molecular Probes, США) в разведении 1:500, который является селективным красителем вещества Ниссля с красной флюоресценцией. Анализ препаратов проводили на флюоресцентном микроскопе Olympus BX43 (Токио, Япония) с соответствующим набором светофильтров и охлаждаемой цифровой CCD-камерой Tucsen TCC 6.1ICE c программным обеспечением ISCapture 3.6 (Китай). Для анализа размеров и относительного содержания иммунопозитивных нейронов на цифровых изображениях гистологических препаратов использовали программу Image J (NIH, США, http://rsb.info.nih.gov/ij/). Долю иммунопозитивных нейронов определяли как их отношение к общему числу нейронов, которое принимали за 100 %. Анализу подлежали нервные клетки, срез которых прошел через ядро. Для определения площади сечения нейронов в случайном порядке брали 100 нейронов, иммунопозитивных к каждому из исследованных маркеров в каждой возрастной группе. Проводили количественную оценку интенсивности флюоресценции, она определялась в условных единицах яркости от черного (0) до белого цвета (255) также при помощи программы Image . Математическая обработка данных проведена с использованием пакета прикладных программ Sigma Plot (StatSoft, USA). Все величины представлены как средняя арифметическая ± ошибка среднего (М±m). Значимость различий средних величин определяли по методикам ANOVA, критериям Вилкоксона и Манна-Уитни. Значимыми считали различия при р<0,05. Результаты исследования. Результаты показали, что КБ, КР, nNOS и НПY выявляются у молодых и старых животных, однако иммунореактивность к вышеуказанным маркерам различается у молодых и старых крыс. Кальбиндин-иммунопозитивные (КБ-ИП) нейроны обладали интенсивной флюоресценцией в ДЯ и ДМЯ (рис. 1, таблица). Интенсивность иммунофлюоресценции к КБ у нейронов в ВМЯ была ниже (p<0,001). В ДЯ и ВМЯ не наблюдалось различий по процентному содержанию КБ-ИП-нейронов между молодыми и старыми крысами (рис. 2). В ДМЯ процентное содержание КБ-ИП-нейронов уменьшалось у старых животных (p<0,001). Интенсивность иммунофлюоресценции КБ-ИП-нейронов во всех трех ядрах при старении не менялась (см. таблицу). Кальретинин (КР) не обнаруживался в ДЯ в обеих группах. Интенсивно флюоресцентные КР-ИП-нейроны выявлялись в ДМЯ и ВМЯ. При старении в ДМЯ и ВМЯ относительное содержание КР-ИП-нейронов значимо увеличивалось (см. рис. 2). Степень иммунофлюоресценции КР-ИП-нейронов в ДМЯ и ВМЯ при старении не изменялась (см. таблицу). У молодых животных nNOS не определялась в ДЯ, а в ДМЯ и ВМЯ выявлялись nNOS-ИП-нейроны со слабой иммунофлюоресценцией. Содержание nNOS-ИП у 3-месячных крыс в ДМЯ составляло 41±3,2 %, в ВМЯ - 58±7,4 %. У старых животных количество nNOS-ИП-нейронов и степень иммунофлюоресценции к nNOS увеличивались во всех исследуемых ядрах. При этом у старых крыс появлялись в большом количестве nNOS-ИП-нейроны в ДЯ (86±4,5 %), в ДМЯ и ВМЯ все нейроны (100 %) приобретали ИП к nNOS. Интенсивно флюоресцирующие НПY-ИП-волокна выявлялись в ДЯ у молодых и старых крыс, при этом степени иммунофлюоресценции (77±5,1 и 71±3,9 соответственно) ИП-волокон между возрастными группами были одинаковы. У молодых крыс выявлялась плотная сеть интенсивно флюоресцирующих НПY-ИП-волокон в ДМЯ (47±2,3), в ВМЯ степень флюоресценции НПY-ИП-волокон была существенно меньше (15±0,9). При старении наблюдались обратные изменения распределения НПY-ИП-волокон в ДМЯ и ВМЯ. У старых крыс иммунофлюоресценция к НПY значительно увеличивалась в ВМЯ (61±3,7) и существенно снижалась в ДМЯ (23±1,8). Средняя площадь сечения ИП-нейронов в ДЯ, ДМЯ и ВМЯ варьировала от 119±9,6 до 137±8,2 мкм2 у крыс обеих групп. Нейроны различных ядер, ИП к различным маркерам, не отличались по этому показателю. Обсуждение полученных данных. К одной из наиболее известных и глубоко разработанных концепций в геронтологии следует отнести элевационную теорию старения, придающую ключевое значение возрастному повышению порога чувствительности гипоталамуса к гомеостатическим сигналам [6]. ВМЯ и ДМЯ гипоталамуса, ответственные за регуляцию обмена веществ и энергии в организме, предположительно играют важную роль и в процессах старения [4]. Среди факторов, регулирующих развитие синапсов и их пластичность, большое значение имеет поддержание определенной концентрации ионов кальция. КБ и КР играют роль кальциевых сенсоров и участвуют в поддержании уровня кальция в клетках [13]. В литературе имеются данные о возрастном снижении экспрессии КБ и КР в коре больших полушарий у грызунов, что делает клетки более чувствительными к изменениям концентрации ионов кальция [2]. Избыточный кальциевый ток, направленный внутрь нейронов, своеобразная перегрузка нейронов кальцием в настоящее время рассматриваются как важные механизмы старения мозга, в частности, дегенерации нейронов и развития возраст-зависимой патологии [9]. Экспрессия фермента синтеза NO - нейрональной синтазы оксида азота (nNOS) в значительной степени ограничивается областями гипоталамуса, которые участвуют в контроле таких функций организма, как энергетический баланс и размножение [3]. Данные настоящего исследования свидетельствуют, что при старении иммунофлюоресценция к nNOS увеличивалась в ДЯ, ДМЯ и ВМЯ, что соответствует ранее полученным данным о возрастании экспрессии nNOS в преоптической области, супраоптическом и паравентрикулярном ядрах, а также в ДЯ у старых крыс [6]. Согласно литературным данным, в ДЯ с возрастом снижается содержание проопиомеланокортина и НПY [7]. Мы обнаружили, что при старении наблюдается увеличение плотности НПY-ИП-волокон в ВМЯ и снижение в ДМЯ. Заключение. Таким образом, при старении изменяется нейрохимический состав исследованных ядер гипоталамуса. При этом уменьшается процент КБ-ИП-, увеличивается доля КР-ИП- и nNOS-ИП-нейронов, изменяется плотность НПY-содержащих волокон в ВМЯ и ДМЯ. Источник финансирования. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 19-15-00039). Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: П. М. М. Сбор и обработка материала: А. А. С., П. А. В., Д. А. А. Статистическая обработка данных: М. Б. К. Анализ и интерпретация данных: В. В. П, А. Д. Н. Написание текста: П. М. М. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов

About the authors

V. V. Porseva

Department of Pathophysiology 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl, 150000

M. B. Korzina

Department of Normal Physiology 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl, 150000

A. A. Spirichev

Department of Normal Physiology 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl, 150000

P. A. Vyshnyakova

Department of Normal Physiology 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl, 150000

D. A. Aryaeva

Department of Normal Physiology 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl, 150000

A. D. Nozdrachev

St. Petersburg State University

Email: a.d.nozdrachev@mail.ru
Department of General Physiology 7-9 University Emb., St. Petersburg, 199034

P. M. Masliukov

Department of Normal Physiology 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl, 150000

References

Supplementary files