MORPHOLOGICAL AND NEUROCHEMICAL CHARACTERISTICS OF THE SUBICULAR COMPLEX OF THE HUMAN FETAL BRAIN

Full Text

Субикулярный комплекс (СК) входит в состав медиальной височной доли (medial temporal lobe), участвует в механизмах долговременной памяти и является её наименее изученной структурой [1, 3]. У человека выделение полей СК осложняется скудными сведениями о нейрохимическом фенотипе его нейронов и объективными ограничениями на гомологию с одноименными структурами животных [1]. В то же время, необходимость четких морфологических характеристик субструктур СК востребована в МРТ-диагностике, так как их объем избирательно уменьшается в зависимости от типа когнитивных нарушений [4]. Цель настоящего исследования - изучение особенностей цито-и хемоархитектоники субикулярного комплекса мозга плода человека на 20-26-й неделях гестации. Выбор пренатального периода объясняется тем, что слабая гирификация коры полушарий, характерная для этого возраста, позволяет более точно выделить особенности корковых формаций. Материал и методы. Исследовано 10 левых полушарий мозга плодов в возрасте 20-26 нед гестации из архива кафедры патологической анатомии с курсом судебной медицины Санкт-Петербургского государственного педиатрического медицинского университета (СПбГПМУ) с соблюдением положений закона № 8-ФЗ, приказа МЗ РФ № 354 от 06.06.2013 г., с одобрением этического комитета СПбГПМУ (протоколы № 6/5 от 10.06.2014 г.; № 2/5 от 06.02.2019 г.). Весь материал с постмортальным периодом продолжительностью не более 24 ч по заключению патологоанатома не имел неврологических патологий и кровоизлияний, показал отрицательную реакцию на герпес-вирусы (1-, 4-йи 5-й типы). Материал фиксировали в 4 % растворе параформальдегида на 0,1М фосфатном буфере, pН 7,4. Блоки височной области полушарий заливали в парафин, фронтальные срезы толщиной 12 мкм готовили на микротоме «Leica» RM 2245 (Leica Microsystems, Германия). Для последующего исследования срезы окрашивали крезиловым фиолетовым по Нисслю или подвергали иммуногистохимической (ИГХ) обработке с применением антител к слойспецифическим белкам: TBR1 (разведение 1:50, Abcam, Великобритания), FOXP1 (1:200, Abcam), SATB2 (1:200, Abcam), CTIP2 (1:20, Abcam). В ходе постмиграционной дифференцировки синтез каждого из этих белков отражает сегрегацию нейронов в определенном слое, их последующую функциональную специализацию. Антитела были успешно использованы для изучения коры большого мозга человека, начиная с 19 нед гестации [5]. Исследование препаратов проводили с помощью микроскопов «Leica» DM 5500 и «Leica» TCS SP5 (Leica Microsystems, Германия). Локализацию ИГХпозитивных нейронов в конкретном слое коры устанавливали путем сопоставления с препаратами, окрашенными по Нисслю. Численность иммунопозитивных клеток определяли по модернизированной методике С. Херкулано [4]. Оценивали абсолютное и относительное (%) число ядер с ИГХ-меткой (SATB2, FOXP1, CTIP2 или TBR1) и ядер, окрашенных DAPI, на 1 мм2 среза. Результаты исследования. В настоящее время нет единой классификации слоев субикулярного комплекса. Для разных его полей мы использовали наиболее распространенные обозначения [1, 3]. У плодов 20-26 нед гестации были выделены три субструктуры: собственно субикулюм (Sub), пресубикулюм (PSub) и парасубикулюм (PaSub). Sub является продолжением гиппокампа, состоит из поверхностного молекулярного слоя I и глубокой клеточной зоны, которая продлевает радиальный и пирамидный слои СА1 гиппокампа, но более редкоклеточная и широкая. Начиная с 23 нед гестации, глубокая зона была разделена на два слоя: образованный пирамидными нейронами py и po, в котором превалировали полиморфные клетки (рисунок, б). PSub отличался тем, что на границе слоя I и глубокой клеточной зоны, которая без видимых изменений продолжается из Sub, появились островки плотно упакованных клеток диаметром от 70 до 100 мкм, разделенные бесклеточными промежутками того же размера. Таких островков в разных исследованных образцах насчитывали от 3 до 5, все они имели четкие границы с подлежащим слоем. Как принято в указанных выше источниках, мы обозначили их слой II+III, а глубокие, переходящие из субикулюма слои, - пирамидный (py) и полиморфный (po). Типичная для периаллокортекса диссеканта в PSu не идентифицировалась (см. рисунок, в). Цитоархитектоника PaSub существенно отличалась от PSub тем, что глубокая часть островков здесь более редкоклеточна, чем поверхностная, что позволило уверенно выделить слои II и III. Одновременно границы между островками сглаживались, слой III становился шире, отделяясь от глубокой клеточной зоны хорошо выраженной бесклеточной диссекантой. Несмотря на то, что слои PaSub не гомологичны слоям неокортекса, для их обозначения мы использовали ту же последовательность римских цифр от I до VI, ориентируясь на обзорные публикации по теме [3]. Таким образом, PaSub приобрел типичное для периаллокортекса строение: слой I - молекулярный или маргинальная зона, слой II представлен островками плотно упакованных клеток, слой III, постепенно расширяющийся от PaSub к энторинальной коре, образован пирамидными нейронами, слой IV (ld) - бесклеточная диссеканта, слой V разделен на подслои: Va - узкий слой крупных пирамидных нейронов, Vb - более мелкоклеточный, слой VI - полиморфный, постепенно переходящий в подлежащее белое вещество (см. рисунок, г). В целом, цитоархитектоника полей субикулярного комплекса соответствует взрослому мозгу [3], но вопросы о границе с аллокортексом, о гомологии слоев глубокой клеточной зоны и критериях выделения слоёв II и III остались открытыми. Для их выяснения было проведено ИГХ-исследование, в результате которого обнаружено, что антитела к слой-специфическим белкам избирательно маркируют нейроны определенных слоев (см. рисунок, а, д, е, ж). Этот факт подтвержден подсчетом ядер нейронов, маркированных SATB2, FOXP1, CTIP2 или TBR1 и ядер, окрашенных DAPI, в каждом конкретном слое (таблица). В слое ру Sub и PSub доля FOXP1+/CTIP2+клеток достигала 40,5 %, при этом паттерн маркированных нейронов продлевался в пирамидный слой поля СА1 гиппокампа. Численностьтаких нейронов резко снижалась в PaSub, где единичные FOXP1+/CTIP2+-клетки обнаружены только в подслое Va. Массово TBR1+-нейроны (до 25 %) появились в слое po Sub на границе с СА1 гиппокампа, далее высокая плотность TBR1+-клеток отмечена в слое VI периаллокортекса, включая PaSub и энторинальную кору. На поверхности островков PSub выявлены SATB2+-нейроны, их число составило в среднем 2,5 % от всех клеток островков. В слое II PaSub доля SATB2+нейронов возросла до 38,5 %, в то время как в слое III - только 10,7 %. Обсуждение полученных данных. В работе установлены ранее неизвестные нейрохимические характеристики субикулярного комплекса мозга плода человека [1, 3]. Поле Sub традиционно рассматривают в составе гиппокампа, обосновывая это сходной с СА1 цитоархитектоникой [1]. По нашим данным, слой py Sub и пирамидный слой поля СА1 содержат FOXP1+/ CTIP2+-клетки, а в слое po Sub сегрегированы TBR1+-нейроны, которые в СА1 отсутствуют. Таким образом, слой ро нейрохимически идентичен слою VI PaSub и энторинальной коры, а слой ру - пирамидному слою поля СА1/, т. е. полю Sub присущи черты двух корковых формаций - аллокортекса и периаллокортекса. Диссеканта, как характерный признак периаллокортекса, дифференцируется только в PaSub, однако дискретные совокупности SATB2+-нейронов, которые она отделяет от слоя FOXP1+/CTIP2+-клеток, появляются в PSub, где диссеканта не имеет вида непрерывного бесклеточного слоя. Мы полагаем, что сегрегация SATB2+ в поверхностных слоях Psub и PaSub подтверждает их принадлежность периаллокортексу. Полученные результаты, уточняющие филогенетические характеристики и анатомические границы субикулярного комплекса, могут быть важны для МРТ-диагностики [4]. Работа выполнена при финансовой поддержке СПбГУ, грант № 1.38.333.2015, использовано оборудование РЦ МиКТ Научного Парка СПбГУ (проект № 109-306) Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Е. И. К., П. А. З., Р. А. Н. Сбор и обработка материала: Л. А. Т, П. А. З. Статистическая обработка данных: А. В. Б., П. А. З. Анализ и интерпретация данных: Е. И. К., П. А. З Написание текста: Е. И. К., Р. А. Н. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

E. I. Krasnoschekova

Saint Petersburg University

Email: krasnelena@gmail.com
Department of Cytology and Histology

P. A. Zykin

Saint Petersburg University

Department of Cytology and Histology

L. A. Tkachenko

Saint Petersburg University

Department of Cytology and Histology

A. V. Baskakov

Saint Petersburg University

Department of Cytology and Histology

R. A. Nasyrov

St. Petersburg State Pediatric Medical University

Email: rrmd99@mail.ru
Department of Pathological Anatomy and Forensic Medicine 2 Litovskaya St., St. Petersburg 194100

References

Supplementary files