THE STUDY OF THE DYNAMICS OF THE MEDIATOR CONTENT OF SYMPATHETIC NEURONS IN EARLY ONTOGENESIS OF CAT

Full Text

Введение. В симпатических узлах в подавляющем большинстве нейронов выявляется фермент синтеза катехоламинов - тирозингидроксилаза (ТГ). Помимо этого, примерно 2/3 нейронов содержат также нейропептид Y (НПY) [14]. Небольшая часть нейронов симпатических ганглиев не содержат катехоламины и являются холинергическими [12, 14]. В отличие от грызунов симпатические узлы хищных млекопитающих и человека содержат нейроны, более разнообразные по медиаторному составу. Например, у крыс некатехоламинергические нейроны содержат фермент синтеза ацетилхолина холинацетилтрансферазу (ХАТ) и вазоинтестинальный полипептид (ВИП) [3, 14]. У кошек в ТГ-негативных нейронах, кроме ацетилхолина и ВИП, также выявляются нейрональная синтаза оксида азота (nNOS) и кальцитонин-ген-родственный пептид (КГРП) [6, 12]. В онтогенезе параллельно с функциональным созреванием в нейронах симпатических узлов идет перестройка медиаторного состава, которая может происходить под влиянием целого ряда различных трофических факторов [7, 8]. У новорожденных и 10-суточных крысят и котят в симпатических узлах выявляется достаточно большой процент кальбиндин (КБ)-иммунореактивных (ИР) нейронов, доля которых значительно уменьшается после первых 10 сут жизни [2, 3]. Также в симпатических узлах крыс после рождения уменьшается процентное содержание соматостатин (СОМ)-ИР-клеток [3, 14]. Целью настоящего исследования явилось выявление локализации и иммуногистохимических характеристик нейронов верхнего шейного (КШГ) и звездчатого (ЗГ) ганглиев симпатической части периферической нервной системы кошки. Материал и методы. Работа выполнена на 20 котятах в возрасте 1, 10, 20, 30 сут (по 5 животных в каждой возрастной группе). Исследование проводили с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 775 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). На проведение исследования получено разрешение этического комитета Ярославского государственного медицинского университета (протокол № 29 от 21.02.2019 г.). Под уретановой анестезией (1 г/кг внутрибрюшинно) животным под фасцию грудиноключично-сосцевидной мышцы с помощью микрошприца вводили 10 мкл маркера ретроградного аксонального транспорта прочный синий [2 % раствор на фосфатносолевом буфере (PBS, 0,01M, рН 7,4)]. Послеоперационный период составлял 24 ч. После введения летальной дозы уретана (3 г/кг внутрибрюшинно) животных перфузировали транскардиально изотоническим раствором NaCl с гепарином, а затем фиксирующей смесью 4 % параформальдегида на PBS. Извлекали верхний шейный (ВШГ) и звездчатый (ЗГ) ганглии, которые фиксировали в течение 2 ч в указанной смеси, после чего промывали трехкратно в PBS в течение 30 мин и оставляли в 20 % растворе сахарозы (pH 7,4) на ночь. Из фиксированного материала на криостате готовили серии срезов толщиной 14 мкм. С целью выявления нейронов, содержащих ТГ, ХАТ, ВИП, НПY, nNOS, КБ и СОМ, применяли двойное иммуногистохимическое мечение по ранее описанной нами методике [2, 12]. С этой целью срезы преинкубировали 30 мин при комнатной температуре в PBS с добавлением 10 % сыворотки, 1 % тритона X-100, 0,1 % бычьего сывороточного альбумина, 0,05 % тимерозола. Затем инкубировали 24 ч при комнатной температуре с первичными антителами (табл. 1). После кратковременной промывки в PBS срезы инкубировали 2 ч с вторичными антителами, конъюгированными с флюорохромами: флюоресцеин-изотиоцианатом (FITC), дающим зеленую флюоресценцию, и индокарбоцианином (Cy3), дающим красную флюоресценцию (разведение 1:150, Jackson Immunoresearch, США). Затем срезы снова отмывали в PBS и заключали в среду для иммунофлюоресценции (VectaShield, Vector Laboratories, США). Анализ гистологических препаратов проводили на флюоресцентном микроскопе Olympus BX43 (Япония) с соответствующим набором светофильтров и охлаждаемой цифровой CCD-камерой Tucsen TCC 6.1ICE c программным обеспечением ISCapture 3.6 (Китай). Нейроны, меченные маркёром FB, выявляли по синей флюоресценции, иммунопозитивные - по зеленой и красной. Для анализа процентного соотношения иммунопозитивных нейронов на цифровых изображениях гистологических препаратов использовали программу Image J (NIH, США, http://rsb.info.nih.gov/ij/). Математическую обработку данных проводили с использованием пакетов прикладных программ Sigma Plot (StatSoft, США). Все величины представлены в виде (x -±s-x), где -х - среднее арифметическое, а s-x - стандартная ошибка среднего. Значимость различий средних величин определяли с использованием однофакторного дисперсионного анализа (Anova) с коррекцией Бонферрони. Значимыми считали различия сравниваемых показателей при р<0,05. Результаты исследования. С момента рождения нейроны, меченные посредством FB, выявляются и в ВШГ, и в ЗГ. В ВШГ такие нейроны располагаются в каудальной области, а вЗГ - преимущественно в медиальной части. Значимых различий по числу нейронов между ганглиями, а также между различными возрастными группами не выявлено (табл. 2, p>0,05). Также не обнаружено значимых различий по числу меченых нейронов в правом и левом узлах (p>0,05). Большинство меченых нейронов у котят всех возрастных групп являются норадренергическими и содержат фермент синтеза норадреналина ТГ (рис. 1). Доля таких нейронов в раннем постнатальном онтогенезе в обоих узлах значимо не меняется и варьирует от 89 до 94 %. У новорожденного котенка лишь небольшая часть нейронов, наряду с ТГ, содержат НПY. Доля таких нейронов значимо увеличивается за первые 10 сут жизни в ЗГ и в течение 20 сут в ВШГ (см. рис. 1, 2), а далее значимо не меняется. Большая часть нейронов, меченных FB, у новорожденных котят в ВШГ и ЗГ являются КБ-ИР (см. рис. 1, 2). Процентное содержание меченых КБ-ИР-нейронов в ВШГ значимо уменьшается с момента рождения до 30-х суток жизни, а в ЗГ - возрастает за первые 10 сут, а затем уменьшается к 30-м суткам (p<0,05). Реакция на антитела к ХАТ, ВИП и nNOS выявляется менее чем у 1 % от общей популяции меченых нейронов в обоих исследованных ганглиях во всех возрастных группах. СОМИР-меченые нейроны в симпатических узлах кошек не обнаружены. Размеры нейронов, меченных FB, увеличиваются в процессе онтогенеза (табл. 3). Значимых различий по средней площади сечения между мечеными нейронами и нейронами, не содержащими метку, не выявлено (p>0,05). Обсуждение полученных данных. Результаты исследования подтверждают ранее полученные методом ретроградного аксонного транспорта сведения о наличии связей нейронов симпатических узлов с органами-мишенями, в частности сосудами скелетных мышц, уже к моменту рождения [1]. В онтогенезе размеры нейронов симпатических узлов увеличиваются. У кошки площадь сечения нейронов ЗГ приобретает размеры, свойственные взрослому животному, к 6-месячному возрасту [3, 11]. В симпатических узлах млекопитающих бóльшая часть нейронов содержат одновременно ТГ и НПY [5, 13]. НПY является не только нейротрансмиттером, способствующим вазоконстрикции сосудов скелетных мышц, но и трофическим фактором, способствующим ангиогенезу [15]. При этом у новорожденных котят, согласно полученным результатам, лишь небольшая часть меченых нейронов симпатических узлов являются НПY-ИР, доля которых в онтогенезе возрастает за первые 20 сут жизни, достигая примерно 2/3 всех нейронов. В литературе есть данные, что в симпатических ганглиях крыс доля НПY-ИР-нейронов, посылающих свои аксоны к сердцу и сосудам скелетных мышц, составляет половину от общего количества меченых нейронов и в онтогенезе не изменяется с момента рождения [13]. Известно, что у кошек связи с сосудами скелетных мышц образуют и холинергические нейроны симпатических узлов, содержащие nNOS и ВИП [6]. В нашем исследовании мы выявили лишь небольшую долю холинергических меченых нейронов в симпатических ганглиях, что свидетельствует о малом их количестве среди подавляющего большинства катехоламинергических нейронов. В отличие от ЗГ грызунов, где в раннем постнатальном онтогенезе доля СОМ-ИРнейронов уменьшается [3, 14], у кошек в ВШГ и ЗГ выявить СОМ-ИР-нейроны нам не удалось. У новорожденного котенка бóльшая часть меченых нейронов являются КБ-ИР. В отличие от кошек у крыс симпатические нейроны, образующие связи с сосудами, не содержат КБ в постнатальном онтогенезе [4]. В развивающихся нейронах при участии ионов кальция происходит регуляция роста нейронов и морфологической пластичности, в частности образования и функционирования конуса роста и развития дендритов [9, 10]. Вероятно, КБ особенно важен на ранних этапах постнатального развития нервной системы, а впоследствии его роль снижается. Заключение. Таким образом, у кошек нейрохимический состав симпатических узлов в первые недели жизни изменяется. Происходит перестройка медиаторного состава нейронов, завершающаяся к 20-м суткам жизни. Автор сообщает об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

A. I. Emanuilov

Yaroslavl’ State Medical University

Email: post_doc@mail.ru
Department of Human Anatomy 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl’ 150000

References

Supplementary files