ULTRASTRUCTURAL CHANGES IN THE NEOCORTEX OF RATS WITH METABOLIC SYNDROME INDUCED BY A HIGH-CALORIE DIET

Full Text

Метаболический синдром (МС) - симптомокомплекс, для которого характерны нарушения обменных и гормональных процессов, вызванные системной инсулиновой резистентностью. Негативное влияние МС на функции мозга во многом обусловлено нарастанием окислительного стресса [4, 7], в условиях которого снижается функциональная активность ЦНС и развиваются ряд нейродегенеративных расстройств [6, 11]. Исследование ранних этапов повреждения неокортекса в условиях МС на ультраструктурном уровне исключительно важно для своевременной компенсации и предупреждения патологических состояний, приводящих к гипоксии корковых формаций мозга и развитию когнитивных нарушений. Наиболее адекватным подходом для создания экспериментальной модели МС является длительное содержание грызунов на диете, обогащенной насыщенными жирами и легкими углеводами. У крыс, получавших высокоуглеводную/высокожировую диету (ВУ/ВЖ-Д), развиваются метаболические нарушения, соответствующие основным критериям МС у человека - повышение удельной массы жировой ткани, гипергликемия, инсулиновая резистентность, дислипидемия, нарушение толерантности к глюкозе [1, 9]. Цель исследования - изучение особенностей нейрональной и глиальной реакции на хроническую гипергликемию и инсулиновую резистентность в неокортексе крыс с МС, индуцированным высококалорийной диетой. Материал и методы. Эксперименты проводили в соответствии с правилами, утвержденными этическим комитетом ИЭФБ РАН (30.12.2015 г.) и согласно правилам и требованиям Директивы Европейского парламента (1986 г.). Для создания модели МС использовали крыс-самцов линии Вистар (20 особей). На 26-е сутки после рождения крысят рандомизировали на 2 группы: контрольную (Кгр, n=10), получавшую экструдированный сухой комбикорм П-120 (ООО «Лабораторкорм»), и с МС (МСгр, n=10), получавшую ВУ/ВЖ-Д, которая в дополнение к стандартному рациону включала 30 % раствор сахарозы (вместо питьевой воды). В качестве источника насыщенных жиров использовали маргарин (5-7 г на крысу в сутки). Уровень глюкозы в крови, полученной из хвостовой вены крыс, определяли с помощью тест-полосок «One Touch Ultra» (США). Уровни триглицеридов (ТГ), общего холестерина (ОХ) и его комплексов с липопротеидами низкой (Х-ЛПНП) и высокой (Х-ЛПВП) плотности определяли с помощью наборов фирмы «Olvex Diagnosticum» (Россия). За 2 сут до окончания эксперимента для оценки чувствительности к глюкозе проводили глюкозотолерантный тест, для чего крысам внутрибрюшинно вводили раствор глюкозы (2 г/ кг) и в течение 120 мин измеряли концентрацию глюкозы в крови. Определяли значение AUC0-120 - площадь под кривой «концентрация глюкозы (мМ) - время (мин)», от 0 до 120 мин. В возрасте 130 сут после 15 нед ВУ/ВЖ-Д животных выводили из эксперимента. Крыс наркотизировали хлоралгидратом (400 мг/кг), затем транскардиально перфузировали фиксирующей смесью, состоящей из 0,5 % глутаральдегида и 4 % параформальдегида при 4 ºС. Кусочки мозга, иссеченные из сенсомоторного отдела неокортекса, дополнительно фиксировали в охлажденном 1 % растворе тетраоксида осмия. После дегидратации образцы заключали в смесь аралдитов. Фронтальные ультратонкие срезы толщиной 50-60 нм получали с помощью ультратома «LKB-III» (Швеция). Для исследования и фотосъемки использовали трансмиссионный электронный микроскоп «FEI Tecnai G2 Spirit BioTWIN» (Нидерланды) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Проводили ультраструктурный анализ нейронов и глиоцитов (астроцитов и олигодендроцитов), а также подсчитывали число межнейронных, нейроглиальных и прямых нейро-вазальных контактов на 1 мкм2. Полученные количественные данные обрабатывали с помощью программы «Microsoft Office Excel 2007» (надстройка «AtteStat 12.5») и программы «GraphPad Prism 7 software» (GraphPad Software, LaJolla, США). Данные представлены в виде средней величины и стандартного отклонения (M±SD) для метаболических показателей и средней величины и стандартной ошибки (M±SEM) для показателей ультраструктурных изменений. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Д’Агостино-Пирсона и Шапиро-Уилка. Для сравнения двух независимых выборок с нормальным распределением использовали двухвыборочный t-критерий Стьюдента. Данные, не удовлетворяющие критериям нормального распределения и не прошедшие тест на равенство дисперсий, обрабатывали с применением непараметрических методов с использованием U-критерия Манна-Уитни. Статистически значимыми считали отличия при уровне значимости р<0,05. Результаты исследования. Крысы с МС имели значимые отличия по сравнению с контролем: большую массу тела (397±25 против 315±17 г в контроле), большее количество абдоминального жира (9,8±2,2 против 4,2±1,2 г), умеренную гипергликемию с концентрацией глюкозы 5,2±0,5 против 3,4±0,4 мМ, повышенный уровень ТГ (1,52±0,30 против 0,96±0,15 мМ), ОХ (5,67±0,49 против 4,07±0,35 мМ), атерогенного Х-ЛПНП (2,90±0,35 против 1,27±0,16 мМ). Содержание Х-ЛПВП в экспериментальной и контрольной группах оставалось одинаковым. С помощью глюкозотолерантного теста показано, что уровень глюкозы через 120 мин после нагрузки и значение у МСгр были значимо выше, чем у Кгр AUC0-120 (7,7±0,7 против 4,0±0,5 мМ, 1312±127 против 887±76 усл. ед.). Анализ ультраструктурных особенностей сенсомоторной коры у Кгр и МСгр позволил выделить четыре типа нейронов, различающихся по состоянию цито-и кариоплазмы, а также степени сохранности мембранных компонентов. Нормохромные нейроны (НрХрН) (рис. 1, а, б, д; 2, а) имели светлую цитоплазму и ядра овальной формы с преобладанием эухроматина. В цитоплазме идентифицировались комплекс Гольджи, гранулярная эндоплазматическая сеть, митохондрии, рибосомы и полирибосомы, а также гранулы липофусцина и элементы цитоскелета. Умеренно гиперхромные нейроны (УмГрХрН) представляли собой реактивно измененные клетки с признаками гипертрофии по количеству органелл и плотности цитоплазмы. Дегенеративные гиперхромные нейроны (ГрХрН) имели электронноплотные ядро и цитоплазму с плохо различимой границей между ними. Цитоплазма была вакуолизирована, что связано с набуханием цистерн эндоплазматической сети, аппарата Гольджи и митохондрий (см. рис. 1, б, г). Специфичными морфологическими признаками нейронов в состоянии апоптоза (АпН) было характерное изменение формы нервной клетки, конденсация хроматина, с образованием гетерохроматиновых структур, гомогенно распределенных по всей кариоплазме (см. рис. 1, в). Относительное содержание НрХрН среди одиночных нейронов неокортекса крыс МСгр снижалась на 13 % по сравнению с Кгр. При этом доля НрХрН в общей популяции нейронов имела тенденцию к снижению (табл. 1). У крыс МСгр доля УмГрХрН и ГрХрН среди одиночных, атакжеихдолявобщейпопуляциинейронов имели тенденцию к увеличению. Доля АпН в общей популяции одиночных нейронов при МС увеличивалась в 5 раз. Общее число межнейрональных пар при МС по сравнению с контролем возрастало в 1,5 раза (83±16 против 55±10). Число прямых нейро-вазальных контактов у крыс МСгр возрастало в 2,3 раза (57,2±14 против 25,5±4) (см. рис. 1, д). При этом доля УмГрХрН, контактирующих с базальной мембраной, увеличивалась в 4,5 раза, ГрХрН - в 2,2 раза, тогда как доля НрХрН уменьшалась в 2 раза (табл. 2). На электронограммах неокортекса крыс выявлены достаточно крупные астроциты и олигодендроциты. Для астроцитов была характерна неправильная форма, ее контур соответствовал элементам в окружающем нейропиле (см. рис. 2, а). Астроциты имели крупные ядра, как правило, с тонким краем гетерохроматина у ядерной оболочки. В обширной бледной цитоплазме часто наблюдали темные гетерогенные включения. Многочисленные отростки астроцитов располагались рядом с нейронами и формировали расширения, почти полностью покрывающие внутрикорные изменения, в частности, скопления в цитоплазме продуктов метаболизма, липофусцина (см. рис. 1, г). Были выявлены олигодендроциты с апоптотическими изменениями ядра - конденсацией гетерохроматина по всей кариоплазме (см. рис. 1, в). С помощью уплощенных концов своих отростков олигодендроциты спирально окружали аксоны нейронов, образуя компактные липидно-белковые мембраны - миелиновые оболочки (МО) (см. рис. 2, а), структурные изменения которых у крыс МСгр имели полиморфный характер (см. рис. 2, в, г). Распространенной формой нарушений являлось расщепление МО разной степени выраженности. В легких случаях оно затрагивало 1-2 смежные ламеллы миелина. В случаях расщепления несколько рядов ламелл, в образующихся «карманах» происходило обширное расширение межламеллярного пространства. Патологическое разрастание миелина приводило к выпячиваниям и инвагинациям оболочки. Выявляли участки с полной деструкцией МО, с гомогенным и зернистым распадом ее мембран (см. рис. 2, в). Наряду с качественными морфофункциональными особенностями глиоцитов, в неокортексе крыс МСгр имели место количественные изменения нейро-глиальных контактов по сравнению с контролем. В контрольной и экспериментальной группах олигодендроциты располагались по соседству с телами нейронов, в результате чего плазматические мембраны клеток-спутников контактировали друг с другом (см. рис. 1, а, г). В целом при МС по сравнению с контролем число нейро-глиальных пар не менялось (67,2±9,0 против 60,5±5,0), но значимо возрастало число контактов между НрХрН и ГрХрГ (в 1,6 раза), а также между ГрХрН и ГрХрГ (в 2 раза) (см. табл. 2). Обсуждение полученных данных. У крыс, длительное время находящихся на ВУ/ ВЖ-Д, развиваются все основные признаки МС, включая умеренную гипергликемию, дислипидемию, инсулиновую резистентность, что негативно отражается на функционировании ЦНС. Проведенные ультраструктурные исследования сенсомоторной коры крыс МСгр это в полной мере подтверждают. Хроническая гипергликемия в сочетании с инсулиновой резистентностью приводят к гиперосмолярности и дегидратации клеток, что нарушает их функциональную активность и выживаемость [12]. При повышении доли УмГрХрН и ГрХрН с необратимой дегенерацией доля НрХрН в общей популяции нейронов неокортекса крыс МСгр значительно снижается. Наши данные, в целом, согласуются с результатами других авторов [3], которые показали, что при фруктозо-индуцированном МС изменения клеточного состава неокортекса носят деструктивнодегенеративный характер. Можно полагать, что снижение доли НрХрН, показанное в работе [3], обусловлено более продолжительным развитием МС и, как следствие, более выраженными метаболическими и функциональными нарушениями. Другим механизмом негативного влияния гипергликемии является изменение активности эндотелиальной NO-синтазы, катализирующей образование оксида азота [10]. В эндотелии сосудов, а также в глиальных клетках и нейронах NO влияет на активность апоптотических процессов, функциональное состояние внеклеточного матрикса, систему антиоксидантной защиты [2]. Таким образом, недостаточность продукции NO может быть одной из причин выявленного нами значительного (в 5 раз) нарастания числа АпН у крыс МСгр. Интерес к нейроглии значительно возрос после того, как была доказана важность нейро-глиальных взаимодействий в регуляции пре-и постнатального нейрогенеза, обеспечении нейрональной трофики и пластичности, межнейронной интеграции и синаптической передачи [13]. Анализ полученных нами ультраструктурных данных показал, что глия в неокортексе крыс восприимчива к повреждающему действию инсулиновой резистентности в условиях МС, что выражается в нарастании числа дегенеративно измененных глиоцитов и в нарушениях структуры миелина. Ранее локальные повреждения структуры миелина были выявлены при ультраструктурном исследовании гиппокампа у крыс линии Zucker, широко используемых как модель хронического диабета 2-го типа [8]. Обнаруженное у крыс МСгр уменьшение доли НрХрН от общего числа одиночных нейронов в сочетании с увеличением нейро-вазальных контактов и участием в них нейронов с деструктивными изменениями (УмГрХрН и ГрХрН) может свидетельствовать об общем гипоксическом статусе неокортекса у крыс с МС. Увеличение числа нейро-вазальных контактов свидетельствует о возрастании потребности нейронов в питательных веществах и кислороде, что особенно важно для УмГрХрН, имеющих высокую метаболическую активность. В условиях гипергликемии гематоэнцефалический барьер нарушается из-за повреждения эндотелия кровеносных сосудов. При этом возникает недостаток полноценного обмена между кровью и клетками глии, что негативно отражается на состоянии близлежащих нейронов [5]. Образующиеся в этих условиях нейро-вазальные контакты будут вызывать дальнейшее повреждение нейронов, способствуя переходу деструктивных изменений в дегенеративные и переводя УмГрХрН в ГрХрН. В итоге компенсаторная реакция на гипоксию, умеренную на начальных стадиях МС, со временем усиливает процессы нейродегенерации и способствует развитию цереброваскулярных осложнений при МС. Адаптивные изменения числа нейро-глиальных пар, компенсаторная стимуляция нейро-вазальных контактов и реактивная гиперактивация энергетического обмена в нейронах при МС являются факторами, ускоряющими деструктивные процессы в неокортексе. Таким образом, обнаруженные нами особенности межклеточных контактов на фоне реактивных и патологических изменений нейронов и макроглии в неокортексе крыс с МС можно трактовать как компенсаторные и адаптивные механизмы мозга в условиях хронической ангиопатической гипоксии, индуцированной гипергликемией и инсулиновой резистентностью. Работа выполнена с использованием средств государственного бюджета по госзаданию Министерства науки и высшего образования РФ (№ АААА-А18-118012290427). Электронный микроскоп предоставлен ЦКП ИЭФБ РАН. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: А. О. Ш., Н. М. П. Сбор и обработка материала: Н. М. П., И. Б. С., К. В. Д., О. В. Ч. Статистическая обработка данных: И. Б. С., К. В. Д. Анализ и интерпретация данных: Н. М. П., О. В. Ч., И. Б. С., К. В. Д., А. О. Ш. Написание текста: О. В. Ч., Н. М. П., А. О. Ш. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

N. M. Paramonova

I. M. Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry

Email: natapa@bk.ru
Laboratory of Molecular Endocrinology and Neurochemistry 44 Toreza av., St. Petersburg 194223

O. V. Chistyakova

I. M. Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry

Laboratory of Molecular Endocrinology and Neurochemistry 44 Toreza av., St. Petersburg 194223

I. B. Sukhov

I. M. Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry

Laboratory of Molecular Endocrinology and Neurochemistry 44 Toreza av., St. Petersburg 194223

K. V. Derkach

I. M. Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry

Laboratory of Molecular Endocrinology and Neurochemistry 44 Toreza av., St. Petersburg 194223

A. O. Shpakov

I. M. Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry

Laboratory of Molecular Endocrinology and Neurochemistry 44 Toreza av., St. Petersburg 194223

References

Supplementary files