COMPLEX ASSESSMENT OF THE ADRENAL MEDULLA RESPONSE TO PARTIAL LASER DESTRUCTION OF A PAIRED ORGAN USING THE METHOD OF NATURAL PERIODIZATION OF BIOLOGICAL PROCESSES

Full Text

Введение. В основе успешного развития биомедицинских оптических технологий, которые все более активно входят в медицинскую практику, особенно в хирургию, лежат фундаментальные исследования реакции биологических тканей на воздействие лазером [2]. В то же время, изменение тканей и органов в ответ на повреждающее воздействие лазером остается малоизученным [10]. В том числе это справедливо для надпочечника и его мозгового вещества - важного звена симпатико-адреналовой системы. В случае повреждения лазером одного из надпочечников в паре дополнительный теоретический и практический интерес представляет изучение ответа противоположного неповрежденного органа. Одним из эффективных способов изучения ответной реакции биологических структур на повреждение является их разносторонняя морфометрия в динамике, однако получаемые при этом наборы разнородных показателей трудно соотнести между собой. Облегчить эту задачу помогает метод естественной периодизации биологических процессов [4] в сочетании с его вариантом, адаптированным для экспериментальных работ [5]. В настоящем исследовании оба варианта метода применены к 2-месячной динамике морфологических показателей неповрежденного мозгового вещества надпочечника после повреждения хирургическим лазером контралатерального органа с целью комплексной оценки морфологических изменений мозгового вещества после данного варианта воздействия. Материал и методы. Исследование проведено на крысах-самцах породы Вистар с массой тела 372±40 г, у 36 из них после наркоза хлороформом осуществлено точечное воздействие хирургическим лазером на левый надпочечник с аблацией части органа, включая мозговое вещество, 5 животных оставлены интактными для контроля. Для воздействия использован диодный хирургический лазер «Лами» (Опттехника, Россия) со стандартными для паренхиматозных органов настройками: длина волны - 1020 нм, мощность излучения - 2,5 Вт, диаметр световода - 400 мкм, 150 импульсов по 190 мс с промежутком в 10 мс (энергия воздействия - 71,25 Дж). Объем удаленных в результате аблации тканей составил 0,30±0,10 мм3 при объеме органа 10,0±2,5 мм3. В 1-, 7-, 14-, 21-, 28-еи 56-е сутки, используя пары эфира, животных выводили из эксперимента по 5-7 на каждый срок и забирали неповрежденные надпочечники. Обращение с животными соответствовало действующим «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г.), Хельсинкской декларации 1975 г., включая её пересмотренный вариант 2000 г., и Директиве 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета от 22.09.2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Для выявления в мозговом веществе надпочечника двух основных субпопуляций хромаффинных клеток - адреналоцитов и норадреналоцитов использовали метод Honore [9], для этого надпочечники фиксировали в глутаровом альдегиде, а приготовленные с парафиновых заливок срезы выдерживали в бихромате калия и окрашивали толуидиновым синим. После обработки адреналоциты становились голубыми, а норадреналоциты - зелеными. Для морфометрии применяли метод стереологии [3] и метод «полей» [1]. На выбранных случайным образом срезах надпочечника на мозговое вещество проецировали окулярную сетку из 60 равноудалённых точек (об. 40, ок. 7, бинокулярная насадка ув. 1,5). По соотношению (проценту) точек с 20 полей, попавших на хромаффиноциты (совместно и отдельно по субпопуляциям), соединительнотканную строму, кровеносные сосуды и нейроны, определяли их относительные доли в мозговом веществе. Согласно основным принципам стереологии, полученные значения относительных долей тканевых компонентов равнозначны их относительным объёмам (объёмным долям) в мозговом веществе. Также на цифровых изображениях срезов (об. 40), выбранных случайным образом, в программе ImageJ обводили периметры адреналоцитов и норадреналоцитов и рассчитывали их размеры (площади сечения). Таким же способом были определены площади ядер каждой субпопуляции хромаффиноцитов и такие параметры их формы, как округлость, выпуклость и вытянутость. Всего изучены 19 показателей. Метод естественной периодизации биологических процессов применен в его оригинальном [4] и адаптированном для экспериментальных исследований вариантах [5]. В первом случае определяли сколько процентов составляет в данный срок каждый показатель от его средней величины за весь период эксперимента, во втором случае - от контроля. Соответственно для каждого срока рассчитывали 2 варианта коэффициентов вариации: Cv, отражающий степень отклонения показателей от их средних величин за весь период эксперимента, и Cvc, отражающий степень отклонения показателей от контроля. По величине и динамике Cv и Cvc оценивали совокупный морфологический ответ мозгового вещества надпочечника и выявляли в нём рамки естественных периодов. Результаты исследования. Выстроенные кривые всех изученных показателей центрированы относительно прямых (100 % по оси ординат) линий, соответствующих контролю и средним величинам за весь период эксперимента. Полученные графики совмещены с графиками кривых Cvc и Cv, характер которых отражает степень разброса показателей в тот или иной срок относительно центрирующих линий контроля или средней по всему эксперименту (рисунок). Cvc за весь период эксперимента колеблется в пределах 4-22 %. При этом кривая Cvc, резко меняя направление, делится на 2 отрезка: 1-14 и 14-56 сут (см. рисунок, в, г). В 1-е сутки кривые показателей имеют наименьшее отклонение от центрирующей линии, и Cvc составляет минимальную за весь срок наблюдения величину в 4,1 %, затем разброс кривых начинает расти. Cvc к 14-м суткам составляет 21,6 % - максимум за весь период эксперимента. С 14-х суток разброс кривых начинает плавно уменьшаться. Соответственно Cvc плавно снижается до конца периода, достигая на 56-е сутки 11,4 %, т. е. вдвое меньше, чем на 14-е сутки. Cv в течение всего эксперимента колеблется в пределах 7-13 %. С 1-х по 7-е сутки он имеет слабо выраженную тенденцию к росту с 12,1 до 12,9 %, затем с 7-х суток он плавно снижается до 7,2-8,5 % на 28-еи 56-е сутки соответственно. В результате кривая Cv не имеет резких переломов, отчетливо разбивающих ее на периоды. Однако совокупность кривых отдельных показателей, складывающихся в характерный рисунок, дополняет общую картину. Между 7-ми и 14-ми сутками кривые большинства отдельных показателей образуют характерную компактную область перекрещивания - «узловую точку». С учетом смены вектора изменений Cv и наличия узловой точки кривая этого коэффициента также разбивается на 2 отрезка: 1-14 и 14-56 сут (см. рисунок, а, б). Вариабельность считается слабой при коэффициенте вариации меньше 10 %, средней - в диапазоне 10-20 % (по некоторым источникам - 10-25 %) и сильной, если коэффициент вариации больше 20 % (по некоторым источникам, если больше 25 %) [7, 8]. Соответственно Cvc, связанный с контролем, показывает пятикратные различия в наименьшей и наибольшей точках от очень слабой вариабельности в начале наблюдения (1-е сутки) до сильной (или верхней границы средней) величины (14-е сутки). После 14-х суток коэффициент Cvc плавно снижается, вплотную приближаясь, но не выходя за границу в 10 %, т. е. средней вариабельности. Cv показывает лишь менее чем двукратное различие между максимумом и минимумом (7,2- 12,1). При этом значения этого коэффициента характеризуются средней вариабельностью, граничащей со слабой до 14-х суток, и низкой вариабельностью, граничащей со средней с 14-х суток до конца наблюдения. Обсуждение полученных данных. Наиболее показательной оказалась траектория кривой Cvc. До 14-х суток она демонстрирует подъём, затем на отрезке 14-56 сут идёт на спад, принимая при этом вид фактически прямой линии, хотя и проходит через 4 временны́е точки. Таким образом, по Cvc, отражающим степень отклонения показателей от их контрольных величин, именно 14-е сутки являются пиковой точкой ответа неповреждённого мозгового вещества надпочечника на лазерное повреждение контралатерального органа. Для сравнения в серии ранее опубликованных автором с коллегами работ было показано, что в органе, неповрежденном лазером, именно на 14-е сутки приходится наиболее ярко выраженный компенсаторно-приспособительный ответ в виде гипертрофии хромаффиноцитов. При этом в поврежденном органе, вплоть до 7-х суток, в части мозгового вещества, оказавшейся вне зоны поражения и выжившей, продолжается гибель хромаффиноцитов, и деструктивные процессы преобладают над восстановительными. С 7-х по 14-е сутки острота воспаления снижается, гибель эндокриноцитов прекращается, и положение стабилизируется, а с 14-х суток восстановительные процессы начинают преобладать над деструктивными. В эту временну΄ю точку устанавливается равновесие между деструктивными и восстановительными процессами, а пик регенеративных изменений приходится на конец 1-го месяца. Факт, что в мозговом веществе неповреждённого надпочечника пик ответа приходится на 14-е сутки, а на 7-е сутки реакция не столь заметна, в то время как в повреждённом парном органе всю 1-ю неделю преобладает деструкция с пиком на 7-е сутки, можно связать с тем, что развивающиеся в поврежденном органе процессы являются прямым ответом на воздействие, в то время как в неповрежденном парном органе этот ответ - опосредованный. По мере снижения сигналов о неблагополучии в поврежденном органе показатели в неповрежденном мозговом веществе плавно нормализуются. При этом, хотя привязанный к контролю коэффициент вариации Cvc после пиковых значений на 14-е сутки (21,6) далее снижается очень отчетливо, он и через 2 мес после воздействия остается более чем вдвое выше, чем в 1-е сутки (11,4 против 4,1). Это объясняется тем, что выжившее после лазерной деструкции мозговое вещество контралатерального надпочечника обладает слабой регенеративной способностью, не восстанавливается до исходного объема [6] и, следовательно, сигналы, стимулирующие системный ответ в неповреждённом мозговом веществе, на позднем сроке, хотя и ослабляются, но не прекращаются. Cv, отражающий степень отклонения показателей от их средних величин, несколько выше на 7-е сутки, чем на 14-е, однако можно обнаружить, что за исключением кривой относительной доли сосудов разброс остальных кривых выше именно на 14-е сутки, соответственно, и Cv без учета сосудов на 14-е сутки выше, чем в другие временны΄е точки. С такой корректировкой данные по Cv, так же как и по Cvc, делают именно 14-е сутки кризисной (переломной) точкой системного ответа на данный тип повреждения. Ситуация с показателем сосудов, выбивающимся из общего ряда, совершенно логична, так как доля сосудов в мозговом веществе надпочечника, в отличие от других показателей, может измениться практически мгновенно в результате притока или оттока крови, при том, что мозговое вещество надпочечника характеризуется наличием объемистых тонкостенных синусоидов. Таким образом, обобщенно по обоим коэффициентам вариации интервал с 1-х по 14-е сутки можно обозначить как период I - усиленного системного ответа, в котором выделяются фаза I.1 - быстрой, но более слабой реакции (1-7- е сутки) и I.2 - фаза медленной, но более сильной реакции (7-14-е сутки). В период с 14-х по 56-е сутки почти все исследованные показатели двигаются к нормализации с плавным снижением коэффициентов вариации и относительно контроля, и относительно средних величин. Этот интервал можно обозначить как период II - нормализации. Выявленная естественная периодизация в неповрежденном мозговом веществе имеет как сходство, так и отличие от таковой в поврежденном парном органе, в котором выявляются: период I - преобладание деструктивных изменений, период II - усиленное восстановление, фаза II.1 - стабилизация, фаза II.2 - преобладание восстановительных процессов и период III - нормализация [5]. Наибольшее отличие выявляется на начальных этапах, наименьшее - на конечных. Кроме возможности анализировать данные по всей совокупности разнородных показателей, метод естественной периодизации даёт возможность оптимизации при планировании аналогичных исследований. Кривые Cvc и Cv через точку 21-е сутки проходят практически по прямой, что говорит о возможности оптимизации эксперимента именно за счет этого срока. Кроме того, отчётливое сближение показателей к концу 2-го месяца наблюдения с контрольными значениями свидетельствует о нецелесообразности и нерациональности продления эксперимента дольше этого срока. Эта информации тем более ценна, что и для поврежденного контралатерального органа оптимизация возможна именно за счет этой же точки 21-е сутки и ограничения срока эксперимента 56-и сутками [5]. Через точку 28-е сутки кривая Cvc проходит по прямой, а Cv - со слабым отклонением, но эта точка очень важна для поврежденного контралатерального органа, поэтому для изучения системного ответа проводить оптимизацию за счет этого срока некорректно. Кризисный характер точки 14-е сутки, выявляемый обоими коэффициентами как для повреждённого органа, так и парного неповреждённого, требует к ней особого внимания и обязательного включения её в эксперимент при планировании аналогичных исследований. Заключение. Таким образом, кризисной точкой системной реакции мозгового вещества надпочечника на лазерное повреждение, как связанной парной структуры, являются 14-е сутки. При планировании аналогичных экспериментов возможна их оптимизация за счет точки 21-е сутки. Продление аналогичных экспериментов дольше 2 мес нецелесообразно. Автор сообщает об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

K. G. Kemoklidze

Yaroslavl’ State Medical University

Email: K_G_K@mail.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl’ 150000

References

Supplementary files