EMBRYONAL DEVELOPMENT OF THE PERITONEAL CONNECTIVE TISSUE OF ALBINO MICE (ELECTRON MICROSCOPIC STUDY)

Full Text

Известно, что соединительная ткань участвует в образовании большинства органов различных систем организма [1]. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные изучению ее строения в условиях нормы и при различных патологиях (экспериментальных и клинических), остаются спорные или малоисследованные вопросы, касающиеся источников ее образования [15, 17], коллагенеза [5, 7, 9] и роли фибробластов в фагоцитозе вне-или внутриклеточных коллагеновых волокон [7, 12, 13]. Эти вопросы изучались в различных анатомических образованиях (сухожилиях, роговице, дерме, связках и др.) половозрелых организмов. Результаты этих исследований изложены в работах, выполненных на эмбриональном материале [2, 4, 6, 15, 17]. Авторы, изучавшие образование коллагеновых волокон в условиях патологии и в период пре-и постнатального развития у различных представителей млекопитающих и птиц, отмечают, что синтез коллагена и проколлагеновых фибрилл осуществляется в гранулярной цитоплазматической сети и элементах комплекса Гольджи фибробластов [1, 8, 14]. Полное созревание тропоколлагеновых фибрилл осуществляется на клеточном уровне [9] или внеклеточно в результате воздействия на тропоколлагеновые фибриллы белков, содержащихся на плазматических мембранах фибробластов и в хлопьевидных массах вокруг них [5, 8, 16]. В опубликованных исследованиях, выполненных на эмбриональном материале, не прослежена дифференцировка клеток мезенхимы в фибробласты и не отражена перестройка последних при образовании ими коллагеновых волокон. Остается нерешенным и вопрос о способе формирования коллагеновых фибрилл [5, 11, 13]. Развитие соединительной ткани при формировании брюшины у мышей осуществляется из мезенхимы [2], клетки которой выселяются на 8-9-е сутки эмбриогенеза из париетального и висцерального листков спланхнотома. Цель работы - изучение ультраструктурных изменений в мезенхиме зародыша, участвующей в эмбриональном развитии соединительной ткани брюшины у мышей. Материал и методы. Материалом для исследования служила брюшина, покрывающая боковую стенку брюшной полости и тонкую кишку у зародышей мыши. Исследования проводили на 13-, 15-, 18-еи 21-е сутки внутриутробного развития. Всего наблюдали 25 зародышей. Все манипуляции с животными были выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР) и «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (приказ МЗ РФ № 267 от 2003 г.). Вывод беременных самок мышей из опыта проводили путем декапитации. Эмбрионы фиксировали в 2,5 % глутаральдегиде с последующей дофиксацией 1 % раствором четырехокиси осмия и заливали в аралдит М. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-111 (BROMMA, Швеция), контрастировали цитратом свинца и уранилацетатом и изучали в электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Япония). Определение диаметра митохондрий и коллагеновых волокон проводили на электронных микрофотографиях (в нм). Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью программы Statistica 10.0. Значимость различий между возрастными группами определяли при помощи критерии Шапиро-Уилка, а также t-критерия Стьюдента и считали значимыми при p<0,05. Результаты исследования. При электронно-микроскопическом изучении париетального и висцерального листков брюшины существенных различий между ними выявлено не было. Субмезотелиальная ткань в брюшине у зародышей 13 сут представлена мезенхимой, состоящей из клеток, соединенных между собой отростками. В местах их контакта отчетливо прослеживаются плазматические мембраны (рис. 1, а). На этой стадии эмбриогенеза дифференцировка клеток мезенхимы сопровождается изменениями, приводящими к появлению многочисленных митозов. Ядра округлой формы занимают в клетке значительную часть цитоплазмы, их ядерная оболочка местами слегка волнистая. Они содержат равномерно распределенный по кариоплазме хроматин и 1 или 2 ядрышка, нередко прилежащие к ядерной оболочке. В цитоплазме равномерно распределены полисомы. Из-за рыхлого их расположения клетки выглядят светлыми. Митохондрии округлой или слегка вытянутой формы с преимущественно поперечно ориентированными кристами и умеренно просветленным матриксом, различаются размером. Средний диаметр их равен 282±18 нм, самые мелкие митохондрии имеют диаметр 210 нм, а крупные - 421 нм. Комплекс Гольджи, образованный 2-3 короткими, узкими канальцами и несколькими мелкими пузырьками, занимает небольшие участки цитоплазмы вблизи ядра. Гранулярная эндоплазматическая сеть представлена немногочисленными, слегка расширенными цистернами, рибосомы на ее мембранах немногочисленны и распределены неравномерно. Содержимое гранулярной эндоплазматической сети выглядит оптически пустым, и только в единичных цистернах наблюдается хлопьевидное вещество невысокой электронной плотности. На 15-е сутки эмбриогенеза субмезотелиальная ткань обоих листков брюшины образована клетками мезенхимы, фибробластами и немногочисленными коллагеновыми волокнами. На этом сроке развития наблюдается дифференцировка клеток мезенхимы, расположенных под мезотелием, в фибробласты. В их цитоплазме увеличено содержание гранулярной эндоплазматической сети, представленной крупными вакуолями, заполненными мелкозернистым веществом. Количество неравномерно расположенных рибосом на ее мембранах увеличено. В вакуолях видны округлые секреторные пузырьки, окруженные гладкой мембраной и содержащие проколлаген в виде одного или нескольких плотных овальных образований (см. рис. 1, б). Иногда в гранулярной эндоплазматической сети наблюдается скопление секреторных пузырьков, содержащих по 4-5 пучков протофибрилл (см. рис. 1, в). В митохондриях видны расширенные просветленные кристы и электронно-плотный матрикс их внутренней полости. Комплекс Гольджи занимает значительные участки цитоплазмы и образован большим количеством удлиненных канальцев, мелких пузырьков и крупных вакуолей. В последних видны тонкие нитевидные образования - проколлагеновые фибриллы. Фибробласты на этом сроке эмбриогенеза имеют различное строение, вблизи них располагаются одиночные или небольшие группы коллагеновых волокон (см. рис. 1, г, д; 2, а). Фибробласты имеют преимущественно удлиненную форму, содержат овальные ядра с неравномерно распределенным хроматином и одним или двумя ядрышками. В ядерной оболочке некоторых фибробластов в результате разрастания наружной мембраны наблюдаются значительные расширения перинуклеарного пространства, заполненного равномерно распределенным, умеренной плотности мелкозернистым веществом и небольшими вакуолями с электронно-плотными мелкими гранулами. Содержимое вакуолей сходно по строению с цитоплазмой клеток, а на внутренней поверхности их мембран просматриваются единичные прикрепленные рибосомы (см. рис. 1, г). Цитоплазма фибробластов содержит многочисленные, плотно расположенные полисомы, овальные или удлиненные митохондрии с плотным матриксом и просветленными кристами. Диаметр последних составляет в среднем 314±20 нм, диаметр мелких митохондрий - 246 нм, крупных - 348 нм. Гранулярная эндоплазматическая сеть образована длинными узкими, нередко разветвленными цистернами или крупными вакуолями с многочисленными связанными с ее мембранами рибосомами. Ее просвет заполнен мелкозернистым веществом, в котором реже, чем в клетках мезенхимы, наблюдаются секреторные вакуоли (см. рис. 1, д). На 15-е и особенно 18-е сутки развития фибробласты активно образуют промежуточное вещество. Вблизи фибробластов и в непосредственном контакте с их цитоплазмой видны тропоколлагеновые фибриллы. Они находятся на различных стадиях превращения в коллагеновые волокна. Также видны небольшие пучки коллагеновых фибрилл со слабо выраженной поперечной исчерченностью, окруженные мембраной, сходной по строению с плазматической (см. рис. 2, а). Коллагеновые волокна, расположенные одиночно или ввиде небольших пучков с отчетливой поперечной исчерченностью, имеют диаметр 22,6±0,9 нм у 15-суточных и 23,4±1,2 нм - у 18-суточных зародышей. В некоторых фибробластах значительные участки их цитоплазмы лишены плазматической мембраны. В этих местах можно видеть непосредственный контакт образующегося промежуточного вещества с цитоплазмой клеток (см. рис. 2, б, в, г). В частности, видны тропоколлагеновые фибриллы, концы которых находятся, с одной стороны, в цитоплазме клетки, а с другой - в основном веществе соединительной ткани. В цитоплазме вблизи этих участков наблюдаются мелкие секреторные вакуоли, содержащие преимущественно по 5 протофибрилл. В некоторых фибробластах секреторные вакуоли образуют в цитоплазме многочисленные скопления. Между секреторными вакуолями наблюдаются нитевидные образования - протофибриллы. На срезах прослеживается их связь с секреторными вакуолями. Фибробласты, утратившие участки цитоплазмы различной величины, встречаются на 15-е и 18-е сутки внутриутробного развития. Структура ядра в фибробластах, лишенных значительной части цитоплазмы, сохранена. В ядерной оболочке расширено перинуклеарное пространство, заполненное мелкой зернистостью и небольшими вакуолями. Наружная ядерная мембрана контактирует непосредственно с основным веществом соединительной ткани (см. рис. 2, д). Сохранившиеся в таких клетках небольшие участки цитоплазмы окружены плазматической мембраной. У 21-суточных зародышей содержание промежуточного вещества, включая коллагеновые и эластические волокна, нарастает по сравнению с 18-суточными, что особенно четко прослеживается в париетальной брюшине. Коллагеновые волокна в париетальной брюшине в виде пучков располагаются параллельно мезотелию в 2-3 ряда. Их диаметр равен, в среднем, 26,8±0,5 нм, он значимо больше, чем на 15-еи 18-е сутки эмбриогенеза. На 21-е сутки митохондрии в фибробластах сохраняют различия в величине их диаметра, варьируя от мелких диаметром 140 нм до крупных, достигающих 317 нм. Однако средний их диаметр 227±17 нм значимо меньше, чем у зародышей на 15-еи 18-е сутки. Митотически делящиеся фибробласты встречаются реже. На всех сроках развития мышей в субмезотелиальной ткани в основном веществе наблюдаются хлопьевидные образования. Особенно их много у зародышей на 15-еи 18-е сутки. К моменту рождения процесс образования промежуточного вещества в обоих листках брюшины не заканчивается. Обсуждение полученных данных. Проведенное исследование показало, что различия в развитии соединительной ткани в висцеральной и париетальной брюшине мышей касаются в основном формирования промежуточного вещества. В висцеральной брюшине оно слабо развито, расположение коллагеновых и эластических волокон отличается от того, что имеет место в париетальной брюшине. Субмезотелиальная ткань 13-суточных зародышей мышей в париетальной и висцеральной брюшине представлена мезенхимой, дифференцировка клеток которой сопровождается неспецифическими изменениями в их строении и активным митотическим делением. Специфическая тканевая дифференцировка клеток мезенхимы и фибробластов в последующие сроки эмбрионального развития (15-21 сут) заключается в увеличении в их цитоплазме содержания полисом, гранулярной эндоплазматической сети, структур комплекса Гольджи, появлении секреторных вакуолей, содержащих проколлаген, нарушении целостности плазматических мембран и частичной утрате цитоплазмы. Биосинтез коллагеновых волокон в брюшине начинается уже в мезенхимных клетках на 15-е сутки развития в виде появления секреторных везикул, содержащих проколлаген и протофибриллы, в гранулярной эндоплазматической сети. В опубликованных исследованиях есть данные о том, что секреторные везикулы были выявлены и в цитоплазме фибробластов развивающихся сухожилий куриных эмбрионов [6], и в цистернах гранулярной цитоплазматической сети при заживлении кожных ран [5]. Большинство исследователей, выполнивших работы на эмбриональном и экспериментальном материале, считают, что образование коллагеновых фибрилл осуществляется путем экзоцитоза [6, 11]. Наблюдаемые в нашем исследовании в развивающейся соединительной ткани зародышей мышей многочисленные фибробласты, контактирующие непосредственно с тропоколлагеновыми фибриллами, с разрушенной плазматической мембраной и частично утраченной цитоплазмой, дают основание говорить о голокриновом способе секреции коллагеновых фибрилл. О возможности голокриновой секреции фибробластами тропоколлагеновых фибрилл упоминается в единичных исследованиях [5, 9]. Подобный тип секреции, сопровождающейся утратой значительных участков цитоплазмы, наблюдался нами в плазматических клетках при их активном образовании иммуноглобулиновых комплексов в слизистой оболочке органов пищеварения при клинической патологии [3]. Признаков фагоцитоза тропоколлагена в фибробластах в исследованный период развития мышей не наблюдалось. Описанное рядом авторов появление в цитоплазме фибробластов при заживлении кожных ран и сухожилий крупных вакуолей, содержащих тропоколлагеновые фибриллы, рассматривается как аутофагоцитоз, направленный на сохранение равновесия между биосинтезом и транспортом секреторного материала в клетке [5, 13]. Образование аутофагосом, содержащих большое количество тропоколлагеновых фибрилл, наблюдалось и в фибробластах куриных эмбрионов после введения в желточный мешок колхицина или винбластина, блокирующих секрецию проколлагена [7]. Многочисленные хлопьевидные массы вблизи фибробластов в период наиболее активного образования коллагена у зародышей мышей могут быть объяснены, по мнению ряда авторов, содержанием в них и на плазматических мембранах клеток протеогликанов и белков, которые необходимы для внеклеточного формирования коллагена [1, 5, 16]. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: В. Ф. И., С. В. К. Сбор и обработка материала: В. Ф. И., С. В. К. Статистическая обработка данных: С. В. К. Анализ и интерпретация данных: В. Ф. И., С. В. К. Написание текста: В. Ф. И. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

V. F. Ivanova

I. I. Mechnikov North-Western State Medical University

Email: vi1202@mail.ru
Central Research Laboratory 47 Piskarevskii av., St. Petersburg 195067

S. V. Kostyukevich

I. I. Mechnikov North-Western State Medical University

Email: Sergei.Kostykevich@szgmu.ru
Department of Medical Biology 47 Piskarevskii av., St. Petersburg 195067

References

Supplementary files