EXPERIMENTAL BASIS OF THE USE OF POLYCAPROLACTONE-BASED SCAFFOLDS MINERALIZED WITH VATERITE FOR STIMULATION OF BONE TISSUE REGENERATION

Full Text

В настоящее время восстановление поврежденных или утраченных тканей организма является одной из наиболее актуальных проблем в таких отраслях медицины, как травматология, ортопедия, челюстно-лицевая хирургия, нейрохирургия, нейроонкология и др. [2, 3]. Для ее решения используют технологии тканевой инженерии, включающие в себя создание трёхмерных пористых и волокнистых матриц - скаффолдов [4]. К современным скаффолдам предъявляются требования биосовместимости [2], способности к биодеградации [6], биологической активности [13]. Костная ткань обладает рядом особенностей, которые необходимо учитывать при создании скаффолдов для замещения ее дефектов. В частности, матрицы должны обладать особыми прочностными характеристиками и длительным периодом биодеградации, чтобы обеспечить оптимальные остеокондуктивные свойства. В этой связи при создании скаффолдов для стимуляции регенерации костной ткани перспективно использование синтетических полимеров, которые имеют ряд преимуществ по сравнению с естественными аналогами. К ним относятся отсутствие набухания при имплантации, более длительный период биодеградации и повышенная прочность, а также возможность модификации этих свойств [7]. Одним из таких полимеров является поликапролактон (ПКЛ), который, не обладая цитотоксическими свойствами, способен к медленной деградации в организме. Этот полимер разрешен Администрацией по продуктам питания и препаратам США (FDA) для биомедицинского применения. В состав скаффолдов, используемых для замещения костной ткани, также включают неорганические вещества, способствующие улучшению остеокондуктивных и остеоиндуктивных свойств [5]. Наиболее часто в состав матриц включают фосфатные и карбонатные соли кальция, в частности, гидроксиапатит, кальцит и ватерит, которые обладают способностью стимулировать пролиферацию и дифференцировку остеобластов [9]. Ватерит представляет собой одну из трех полиморфных модификаций CaCO3. В качестве компонента скаффолдов ватерит обладает рядом преимуществ: он является прямым источником кальция, который непосредственно необходим при остеогенезе, имеет легкие и доступные условия синтеза и разложения [12], а также способен выполнять функцию адресной доставки биологически активных веществ [5, 8, 11]. В этой связи целью настоящего исследования было изучение регенерации костной ткани при имплантации поликапролактоновых скаффолдов, минерализованных ватеритом. Материал и методы. Экспериментальные исследования выполнены на 20 белых нелинейных крысах-самцах массой 200-260 г. Экспериментальная работа проводилась в соответствии с Конвенцией по защите животных, используемых в экспериментах и для других научных целей (принятой Советом Европы в 1986 г.), Хельсинкской декларацией по вопросам медицинской этики и Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных (1989), приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями Этического комитета Саратовского государственного медицинского университета им. В. И. Разумовского (протокол № 6 от 06.02.2018 г.). Экспериментальные животные были разделены случайным образом на две группы: контрольную и подопытную. Контрольная группа включала 10 животных, которым в область дефекта бедренной кости имплантировали поликапролактоновые матрицы, лишенные биосовместимости. Подопытная группа включала 10 белых крыс, которым в область дефекта бедренной кости имплантировали поликапролактоновые скаффолды, минерализованные ватеритом. Для имплантации использовали матрицы на основе поликапролактона (ПКЛ), изготовленные методом электроформования Центром технологий Томского национального исследовательского политехнического университета и Образовательно-научным институтом наноструктур и биосистем. В состав ПКЛ-матриц входили два типа волокон: микрофибриллярный компонент, толщина волокон которого составляла 12,1±3,3 мкм, и нанофибриллярный компонент со средним диаметром волокон 0,5±0,1 мкм. Для имплантации животным подопытной группы использовались скаффолды, минерализованные ватеритом (СаСО3) по специальной методике [9]. В качестве матрицы, не обладающей биосовместимостью, использовался неминерализованный ПКЛ-скаффолд с адсорбированным в асептических условиях чужеродным белком (овальбумином). При имплантации матриц с целью достижения наркоза экспериментальным животным за 5 мин до проведения оперативного вмешательства внутримышечно вводилась комбинация телазола («ZoetisInc», США) в дозе 0,1 мл/кг и ксилазина («Interchemie», Нидерланды) в дозе 1 мг/кг. Для имплантации матриц проводился разрез предварительно депилированной и обработанной антисептиком кожи латеральной поверхности бедра длиной порядка 2,5 см. Тупым и острым способом выполнялся доступ к бедренной кости. С помощью алмазного диска и электродрели в диафизе бедренной кости формировался дефект в виде линейного продольного пропила длиной 5-7 мм, шириной 1-2 мм и глубиной до костномозговой полости (порядка 2-3 мм). В соответствии с формой дефекта имплантировался скаффолд в виде пластинки 5×2×2 мм. Рана ушивалась послойно наглухо с использованием нерассасывающейся монофиламентной нити Resorpen 3-0 USP («RESORBA MedicalGmbH», Германия). Через 28 сут животных выводили из эксперимента путем передозировки препаратов для наркоза. Бедренная кость извлекалась, отделялась от мышц и связочного аппарата, после чего фиксировалась в 10 % растворе нейтрального формалина (ООО «Биовитрум», Россия). Перед гистологическим исследованием образцы бедренной кости подвергались деминерализации электролитным декальцинирующим раствором («ЭргоПродакшн», Россия) в течение 1 сут. После этого для изготовления препаратов вырезался участок бедренной кости, содержащий зону имплантации длиной около 5 мм. Образцы обезвоживали в спиртах восходящей крепости, после чего заливали в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином Майера и эозином (ООО «Биовитрум», Россия). Анализ препаратов проводили с использованием микроскопа AxioImager Z2 («CarlZeiss», Германия) и микровизора проходящего света серии μVizo-103 (ООО «ЛОМО ФОТОНИКА», Россия). При микроскопии оценивали выраженность периостальной и эндостальной реакций, наличие и состав регенерата вокруг скаффолда, тканевой состав матрицы. Для количественной характеристики биосовместимости матрицы проводился подсчет числа гигантских многоядерных клеток в 5 полях зрения матрицы при увеличении объектива 63 с последующим вычислением их среднего числа на одно поле зрения. Остеоинтеграцию матриц оценивали качественно по наличию костной ткани, соединяющей матрицу и края дефекта кортикальной пластинки. В участках матрицы, расположенных в костномозговой полости за пределами дефекта кортикальной пластинки, остеоинтеграция оценивалась по наличию анастомозов между костными балками, находящимися в матрице и прилежащими к ней по периферии. В участках, не имеющих таких анастомозов, измеряли минимальное расстояние между краями матрицы и прилежащими к ней костными балками с 3 сторон: со стороны 2 краев матрицы и в области ее центральной (торцевой) части, находящейся наиболее глубоко в костномозговой полости. Для характеристики остеоиндуктивных свойств проводилось измерение средней площади и периметра костных балок в скаффолде: в каждом случае измеряли по 5 костных балок. Статистическую обработку полученных данных осуществляли при помощи пакета программ Statistica 10.0. Проверяли гипотезы о виде распределений (критерий Шапиро-Уилкса). Большинство наших данных не соответствовали закону нормального распределения, поэтому для каждого вариационного ряда определялась медиана, верхний и нижний квартили, а для сравнения значений между данными контрольной и экспериментальной групп использовали U-критерий Манна-Уитни, на основании которого судили о значимости различий. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Результаты исследования. В результате гистологического исследования поперечных срезов диафиза бедренной кости животных контрольной группы на 28-е сутки эксперимента в 70 % случаев наблюдалась генерализованная периостальная реакция, сопровождающаяся разрастанием остеоидной ткани по всему периметру диафиза бедренной кости (периостоз). В 30 % периостальная реакция локализовалась в области дефекта, в 50 % случаев она сопровождалась эндостальной реакцией с разрастанием остеоидной ткани в костномозговой полости. В 70 % случаев в области имплантации отмечалось разрастание соединительной ткани, формирующей барьер, окружающий матрицу по периферии (рис. 1, a). У 20 % животных наблюдались отек и воспалительная инфильтрация с преобладанием лимфоцитов в соединительной ткани, окружающей матрицу. Диастаз между матрицей и краями дефекта кортикальной пластинки с двух сторон наблюдался в 50 % случаев. Связь матрицы с краями дефекта посредством соединительной ткани обнаружена в 30 % случаев с двух сторон, а в 20 % - с одной стороны. В 60 % случаев по периферии части матрицы, расположенной в полости диафиза, отмечалось формирование костных балок. Тем не менее, из таблицы видно, что по всему периметру минимальное расстояние между матрицей и окружающими костными балками составляет порядка 30 мкм, т. е. скаффолд не спаян с костной тканью. У животных контрольной группы матрица заселена единичными фибробластами (см. рис. 1, б), имеются участки, не заселенные клеточными элементами. Васкуляризации скаффолда не выявлено. У большинства животных обнаруживаются участки скаффолда, инфильтрированные элементами костного мозга. В структуре матрицы обнаруживаются многочисленные гигантские многоядерные клетки, располагающиеся, как правило, одиночно или в виде небольших скоплений. В среднем по группе число многоядерных клеток в поле зрения (об. 63) составляет 2,8 (2,6; 3,6). Ни у одного из животных данной группы не выявлено костной ткани в матрице. У животных подопытной группы на препаратах диафиза бедренной кости периостальной и эндостальной реакций не отмечалось в 60 % случаев. У остальных обнаружены локальные периостальные или эндостальные реакции, проявляющиеся разрастанием остеоидной ткани в области дефекта. В отличие от контрольной группы у животных подопытной группы не наблюдалось генерализованной периостальной реакции, а также признаков формирования соединительнотканного барьера вокруг матрицы (рис. 2, a). При оценке остеоинтеграции скаффолда установлено, что в 30 % случаев матрица с двух сторон соединена с краями дефекта кортикальной пластинки костными балками, в 30 % случаев такое соединение наблюдалось с одной стороны. У 40 % животных наблюдался диастаз между краями дефекта кортикальной пластинки и скаффолдом с двух сторон. У всех животных подопытной группы отмечалось формирование костных балок вокруг части матрицы, расположенной в костномозговой полости, которые анастомозировали с костными балками скаффолда. В участках, не имеющих видимых анастомозов, минимальное расстояние между краем скаффолда и окружающими его костными балками у животных подопытной группы было меньше, чем в контрольной группе (см. таблицу), составляя порядка 10-14 мкм. У животных подопытной группы большую часть площади скаффолда занимали костные балки, анастомозирующие между собой (см. рис. 2, б) и костными балками, прилежащими к скаффолду по периферии. Площадь балки составила в среднем 2299,95 мкм2 (1850,54; 2373,96), ее периметр в среднем - 0,2024 мм (0,1952; 0,2376). Отдельные участки костных балок окрашивались базофильно. В матрице отмечались единичные тонкостенные сосуды. В пространствах между костными балками матрица заполнена фибробластами, между балками визуализировались соединительнотканные прослойки. В этих прослойках обнаруживались единичные гигантские многоядерные клетки. Число гигантских многоядерных клеток составляло в среднем 0,8 (0,6; 1,2) в одном поле зрения (об. 63), что значимо меньше, чем в контрольной группе (р≤0,001). Обсуждение полученных данных. Результаты исследования гистологических препаратов диафиза бедренной кости крыс контрольной группы позволяют выделить ряд морфологических признаков, характерных для отсутствия биосовместимости скаффолдов при их имплантации в костную ткань, включая выраженные периостальные и эндостальные реакции, разрастание соединительной ткани и формирование отграничивающего барьера. В ряде случаев отграничение матрицы у животных контрольной группы происходит не только за счет соединительной, но и костной ткани вследствие формирования балок по периферии матрицы. Признаком отсутствия биосовместимости также является большое число гигантских многоядерных клеток на фоне слабого заселения матрицы другими клеточными типами. Матрицы, содержащие чужеродный белок, имеют низкую степень остеоинтеграции, не васкуляризуются, не обладают остеоиндуктивным свойством. Изученные на модели имплантации в костную ткань признаки отсутствия биосовместимости частично соответствуют тем, что были получены в результате подкожной имплантации ПКЛ-матриц с адсорбированным чужеродным белком и описаны ранее [1]. В частности, общими признаками отсутствия биосовместимости скаффолдов при имплантациях под кожу и в костную ткань являются отграничение матрицы, отсутствие ее заселения и васкуляризации. При этом следует отметить, что на модели имплантации в костную ткань по сравнению с субкутанными имплантационными тестами меньше выражена инфильтрация матрицы нейтрофилами, а перифокальной области - лимфоцитами. В ходе настоящего исследования установлено, что при имплантации в дефект бедренной кости ПКЛ/CaCO3-скаффолда признаков отсутствия биосовместимости не отмечается, матрица хорошо интегрируется в костную ткань и обладает выраженным остеоиндуктивным свойством. Полученные результаты согласуются с данными исследований in vitro, согласно которым ПКЛ/CaCO3-скаффолд не оказывает цитотоксического свойства [8], а также с данными субкутанных имплантационных тестов, свидетельствующих о биосовместимости матриц данного типа [9]. Вместе с тем, следует отметить, что предшествующие работы демонстрировали заселение ПКЛ/CaCO3-скаффолда фибробластическими элементами in vitro и in vivo. Обнаруженное в ходе настоящей работы образование костных балок в ПКЛ/CaCO3-скаффолдах свидетельствует об их выраженном влиянии на интенсивность остеогенеза в зоне костного дефекта, что, вероятно, обусловлено ранее описанной в литературе способностью ватерита стимулировать пролиферацию и дифференцировку остеобластов [10]. Выводы. При имплантации в костную ткань экспериментальных животных признаками отсутствия биосовместимости скаффолдов являются разрастание соединительной ткани и формирование отграничивающего барьера вокруг матриц, а также накопление в них гигантских многоядерных клеток. Отсутствие биосовместимости препятствует васкуляризации и остеогенезу в скаффолдах, а также их остеоинтеграции при имплантации в костную ткань экспериментальных животных. ПКЛ/CaCO3-скаффолды биосовместимы, хорошо интегрируются в костную ткань экспериментальных животных, обладают выраженным остеоиндуктивным свойством, что проявляется образованием костных балок в матрице, анастомозирующих с костными балками, расположенными по периферии и краям дефекта кортикальной пластинки. Результаты имплантационных тестов ПКЛ/CaCO3-скаффолдов могут рассматриваться в качестве экспериментального обоснования для клинической апробации данного типа матриц с целью стимуляции регенерации костной ткани у пациентов травматологического и ортопедического профиля. Работа выполнена в рамках государственного задания ГБОУ ВО «Саратовский государственный медицинский университет им. В. И. Разумовского» № 154018-04 «Разработка технологии оценки регенераторного потенциала матриц для замещения дефектов костной ткани на основе параметров их васкуляризации». Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: А. Н. И., М. С. С., Р. А. С., И. А. Н., Б. В. П. Сбор и обработка материала: М. С. С., М. О. К., С. Н. Г. Статистическая обработка данных: Д. А. Т., М. О. К. Анализ и интерпретация данных: А. Н. И., С. Н. Г., И. О. Б. Написание текста: А. Н. И., Д. А. Т., М. С. С., Р. А. С., В. Ю. У. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

A. N. Ivanov

Saratov State Medical University

Email: lex558452@gmail.com
Department of Fundamental, Clinical and Experimental Researches, Research Institute of Traumatology, Orthopedics and Neurosurgery 148 Chernyshevskogo St, Saratov 410002

M. S. Savelyeva

Saratov State University

Email: mssaveleva@yandex.ru
Remote Controlled Theranostics Systems Lab, Education and Research Institute of Nanostructures and Biosystems 83 Astrakhanskaya Street, Saratov 410012

M. O. Kurtukova

Saratov State Medical University

Email: kurtukovamaria@mail.ru
Department of Histology 112 Bolshaya Kazachya St, Saratov 410012

D. A. Tyapkina

Saratov State Medical University

Department of Histology 112 Bolshaya Kazachya St, Saratov 410012

R. A. Surmenev

National Research Tomsk Polytechnic University

Research Center for Physical Materials Science and Composite Materials 30 Lenin av., Tomsk 634050

M. A. Surmeneva

National Research Tomsk Polytechnic University

Research Center for Physical Materials Science and Composite Materials 30 Lenin av., Tomsk 634050

B. V. Parakhonskiy

Saratov State University

Remote Controlled Theranostics Systems Lab, Education and Research Institute of Nanostructures and Biosystems 83 Astrakhanskaya Street, Saratov 410012

S. N. Shkarina

National Research Tomsk Polytechnic University

Research Center for Physical Materials Science and Composite Materials 30 Lenin av., Tomsk 634050

V. Yu. Ul’yanov

Saratov State Medical University

Department of Fundamental, Clinical and Experimental Researches, Research Institute of Traumatology, Orthopedics and Neurosurgery 148 Chernyshevskogo St, Saratov 410002

I. O. Bugaeva

Saratov State Medical University

Department of Histology 112 Bolshaya Kazachya St, Saratov 410012

I. A. Norkin

Saratov State Medical University

Department of Fundamental, Clinical and Experimental Researches, Research Institute of Traumatology, Orthopedics and Neurosurgery 148 Chernyshevskogo St, Saratov 410002

References

Supplementary files