Postnatal neurogenesis in the human brain

Full Text

Нейрогенез – это образование функциональных нейронов из нейрональных стволовых клеток (НСК) на протяжении жизни [1]. Он начинается с асимметричного деления НСК с дальнейшей пролиферацией вновь образующихся клеток, дифференцировкой нейронов и миграцией зрелых клеток [2]. Данный процесс связан с познанием, обучением, памятью, упражнениями и стрессовыми реакциями [3, 4]. У человека в постнатальном головном мозгу он происходит в субвентрикулярной зоне (СВЗ) в стенках боковых желудочков и в субгранулярной зоне (СГЗ) гиппокампа [5]. В 1985 г. Полежаев Л.В. показал возможность регенерации нейронов при трансплантации ткани головного мозга не только новорожденным, но и взрослым млекопитающим, не только здоровым, но и перенёсшим острую гипоксию. При этом между нейронами трансплантата и мозга реципиента возникала тесная синаптическая связь [3]. Приоритет открытия нейрогенеза у животных и человека принадлежит отечественным исследователям Поленову А.Л. [6, 7] и Четверухину В.К. [8]. В 1965 г. Altman и Das опубликовали сведения, доказывающие постнатальный нейрогенез у крыс в зубчатой извилине гиппокампа [3]. Обнаружение вновь возникших гранулярных нейронов было основано на стабильном включении в S-фазу маркера бромдезоксиуридина (БДУ) в ДНК делящихся НСК. В последующем проводилась иммуногистохимическая визуализация БДУ в нейронах. Подобные исследования долгое время были возможны только на животных [9]. Однако в 1998 г. Eriksson с соавт. опубликовали работу об изучении тканей головного мозга умерших людей, принимавших БДУ при жизни в качестве противоопухолевой терапии. Включение БДУ было обнаружено в гранулярных нейронах гиппокампа у людей даже в возрасте 72 лет [10]. Впервые НСК, способные к симметричным (поддержание неограниченного самовоспроизведения) и асимметричным (образование дочерних клеток) митозам, были описаны в 1992 г. Reynolds и Weiss. Исследователи культивировали полученные из нейрогенных областей головного мозга мышей клетки, которые образовывали нейросферы (свободноплавающие шарообразные клоны) [11].

На ранних этапах развития головного мозга НСК представлены клетками радиальной глии и нейро- эпителия. У взрослого человека свойствами НСК характеризуются своеобразные астроцитарные клетки, сходные по молекулярным свойствам и морфологии с клетками радиальной глии [12]. НСК обнаружены не только в СВЗ человека, но и в других областях головного мозга человека, где они проявляют пролиферативный потенциал и способность к асимметричным делениям с образованием как нейрональных клеток-предшественниц [13] и нейронов, так и глиальных клеток [14]. Описано образование новых нейронов в гипоталамусе [15].

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ НЕЙРОГЕНЕЗА

Нейрогенез в головном мозгу млекопитающих состоит из 5 стадий развития:

1) активация покоящейся радиальной глии в СГЗ;

2) пролиферация нерадиальных прекурсоров и промежуточных предшественников;

3) генерация нейробластов;

4) интеграция незрелых нейронов;

5) созревание клеток [16].

Было показано, что разные НСК обладают различным пролиферативным потенциалом. Тогда как одни НСК быстро прекращают свою нейрогенную активность, другие повторно активируются из состояния покоя, поддерживая нейрогенез. В то же время небольшая часть НСК может вернуться обратно во временное состояние покоя за счёт деградации фактора проактивации Ascl1. В соответствии с этим НСК, изолированные из СВЗ, подразделяют на 4 группы: спящие, покоящиеся, активированные и клетки-предшественники [17]. Состав и строение пролиферативных зон СВЗ и СГЗ несколько отличаются. Гистологически в СВЗ различают клетки типа А, В, С и Е. Из них В-клетки (потомки радиальной глии) наиболее крупные, контактируют с полостями желудочков мозга и экспрессируют виментин, десмин и глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP). Клетки типа А представлены мигрирующими нейробластами округлой формы с двумя отростками. Они экспрессируют белок даблкортин (DCX) и фактор транскрипии Dlx. Для промежуточных посредников, клеток типа С, маркерными продуктами являются Dlx2, Mash1 и рецептор эпидермального фактора роста (EGFR). Клетки типа Е представлены эпендимными клетками, выстилающими полости боковых желудочков мозга [18]. Нейрональные предшественники СГЗ подразделяются на клетки I типа – «предварительные», экспрессирующие нестин, ароматазу В, GFAP, Sox1, Sox2, BLBP, GLAST; IIа – ранние прогениторы, IIb – коммитированные нейральные прогениторы и III – клетки с электрофизиологическими характеристиками (нейробласты) [18, 19].

НСК, представленные радиальной глией, становятся источниками как олигодендроцитов и астроцитов, так и нейронов. Эти клетки морфологически сходны с нейроэпителиальными клетками, но экспрессируют маркерные для астроцитов белки (ароматаза В, тирозингидроксилаза, ГАМК, виментин, S-100, белки BLBP и GLAST). Для выявления НСК определяют также ряд других специфических молекулярных идентификаторов, таких как мембранные гликопротеины CD24, CD44, CD81, CD90, CD133, CD184, факторы транскрипции Sox1, Sox2, белки Nestin, Prominin-1, Musashi 1, SSEA-1/LeX, PSA-NCAM, ABCG2 [12]. Кроме того, различные НСК в СВЗ регулируются специфическими факторами транскрипции Nkx6.2, Zic, Gsx2, Pax6, которые могут быть использованы для идентификации данных клеток [17]. Было показано также, что подмножество CD133+ эпендимных клеток (спящие НСК) в ЦНС могут быть реактивированы для дифференцировки в нейроны под влиянием VEGF (vascular endothelial growth factor) и bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) [20].

ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЙРОГЕНЕЗА НА ЖИВОТНЫХ

Важной основой для исследования нейрогенеза у взрослых млекопитающих стало обнаружение их сходства с данными процессами у человека [17]. Нейрогенез в головном мозгу взрослых организмов сохраняется у всех изученных видов млекопитающих [9], за исключением большинства видов летучих мышей [21]. Для определения особенностей пролиферации НСК и их дочерних клеток, а также возможного влияния на них различных факторов, проведены многочисленные эксперименты, которые могут стать основой для применения в клинике. В 1985 г. Полежаев Л.В. выявил возможность регенерации нейронов при трансплантации ткани головного мозга не только новорожденным, но и взрослым млекопитающим, здоровым и перенёсшим острую гипоксию. Было показано, что между нейронами трансплантата и мозга реципиента возникает тесная синаптическая связь [22].

Нейрогенез взрослых животных обнаружен у амфибий, рыб и птиц. Было показано, что данный процесс у видов, не относящихся к млекопитающим, является эволюционно консервативным и обладает более высоким регенеративным потенциалом, чем у млекопитающих [23]. В экспериментах на взрослых рыбках данио in vivo было обнаружено, что нейроны образуются как путём прямого превращения НСК в постмитотические, так и через промежуточные предшественники. Данные закономерности выявлены для интактного и повреждённого головного мозга, в котором предшественники нейронов вербуются к месту повреждения с последующим симметричным делением [24]. В 2010 г. проведено исследование с целью определения, насколько полученные на моделях животных данные отражают состояние головного мозга взрослого и стареющего человека. Было обнаружено, что в гиппокампе взрослого человека характерные признаки нейрогенеза и их изменения с возрастом сходны с таковыми у взрослых грызунов [9]. Подобные исследования перспективны для экспериментального моделирования медикаментозной коррекции нарушенного нейрогенеза при старении и нейродегенеративных заболеваниях. В частности, в экспериментах на крысах было показано, что, несмотря на выраженное угнетение образования гранулярных нейронов в гиппокампе стареющих животных, снижение уровня кортикостероидов восстанавливало скорость клеточной пролиферации. В результате увеличивалось количество новых нервных клеток [25]. Полученные данные продемонстрировали взаимосвязь эндокринной системы с нейрогенезом при старении, что перспективно в плане фармакокоррекции морфофункциональных нарушений в головном мозге. В одной из работ при исследовании антидепрессанта флуоксетина, ингибитора обратного захвата серотонина, была использована репортерная линия мышей с идентифицированными и классифицированными НСК. Это позволило проводить точную количественную оценку изменений, вызванных различными агентами. Было продемонстрировано, что флуоксетин не влияет на деление НСК в СГЗ, но усиливает симметричное деление одного из классов ранних клеток предшественников [26].

РЕГУЛЯЦИЯ НЕЙРОГЕНЕЗА

Управление нейрогенезом различается в разные возрастные периоды. В раннем эмбриогенезе основными регуляторами являются фактор транскрипции Sox2 и белок Nestin [12]. Внутриклеточный фактор Sox2 сдерживает передачу сигналов Notch для поддержания пула нейрональных предшественников. Внеклеточный фактор Nestin также воздействует на Notch, способствуя дифференцировке радиальной глии [27]. В СВЗ взрослого человека Nestin-CreERT2 вызывает делецию RBPj, медиатора всех Notch-рецепторов. Выявлены различные сигнальные пути (Notch, Shh, Wnt, BMP), регулирующие нейрогенез [16]. Одним из основных механизмов поддержания НСК являются сигнальные пути Notch. У эмбрионов НСК и нейробласты экспрессируют рецепторы Notch. Сигнальный каскад Notch индуцирует экспрессию транскрипционных факторов HES1 и HES5 (члены семейства генов HES, кодирующих ядерные белки, которые подавляют транскрипцию) в головном мозге [28].

Механизмы использования Notch эволюционно консервативны для всех многоклеточных животных с наличием одного вида рецептора у дрозофилы, двух – у Caenorhabditis elegans и четырёх у млекопитающих. В НСК сигналы Notch поддерживают недифференцированное и мультипотентное состояние, ингибируя дифференцировку [29]. Белок Shh (Sonic hedgehog) участвует в регуляции радиальной глии посредством сигнального пути Hedgehog. Этот внеклеточный фактор необходим для формирования и поддержания НСК в зонах нейрогенеза взрослого человека [27]. Белки Wnt – модифицируемые липидами высоко консервативные гликопротеины, относящиеся к сигнальным молекулам. Для активации внутриклеточной трансдукции Wnt связываются с рецепторами FZD. Wnt влияют на канонические Wnt/β-катениновые пути и на неканонические (β-катенин-независимые пути). В головном мозгу Wnt регулируют самообновление, поддержание и дифференцировку НСК на протяжении всей жизни [30]. Внеклеточный фактор BMP (Bone Morphogenic Protein) поддерживает дифференцировку глиальных клеток и препятствует дифференцировке нейронов [27].

Важными регуляторами нейрогенеза взрослых являются также факторы роста, нейротрофины, цитокины и гормоны. Разные фазы взрослого нейрогенеза управляются нейромедиаторными системами. Например, глутамат, ГАМК и ацетилхолин, напрямую регулируют миграцию, созревание, интеграцию и выживание вновь возникающих нейронов. Антидепрессанты, используемые в клинике и воздействующие на уровне серотонина и нор- адреналина, усиливают пролиферацию нейрональных предшественников в гиппокампе взрослых людей [16]. В регуляции нейрогенеза гиппокампа взрослых участвуют микроглия (частично опосредованная передачей сигналов фракталкина CX3CL1/CX3CR1) и клетки иммунной системы (включая перициты, тучные клетки, Т-лимфоциты и периваскулярные макрофаги). Выявлена роль врождённой и адаптивной иммунной системы в снижении нейрогенеза гиппокампа при физиологическом старении. Микроглиальные клетки способны вызывать воспалительные процессы в ЦНС при активации их рецепторов, распознающих связанные с патогенами или клеточным повреждением молекулы. Помимо нейрогенеза, микроглия участвует в фагоцитозе апоптических клеток и их остатков, эпигенетическом надзоре и синаптической пластичности [31]. Было показано, что нейрогенез и олигодендрогенез НСК взрослых мышей блокируется ассоциированной с воспалением микроглией (связано с продукцией фактора некроза опухолей альфа) и индуцируется микроглией, активированной интерлейкином-4 и низкими уровнями интерферона-гамма [32]. Доказательство того, что нейрогенез ассоциируется с рекрутированием Т-лимфоцитов и активацией микроглии, было получено в экспериментах. У иммунодефицитных мышей нейрогенез значительно нарушался, но восстанавливался при помощи Т-лимфоцитов, которые распознают специфические антигены ЦНС и способствуют экспрессии нейротрофического фактора в зубчатой извилине гиппокампа [33].

ПРОТИВОРЕЧИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ НЕЙРОГЕНЕЗА

Опровержения возможности пролиферации НСК публиковались различными авторами ещё в XX в. Рядом исследователей оспаривалась возможность деления и дифференцировки НСК в зонах нейрогенеза взрослых млекопитающих. В 2016 г. Dennis с соавт. показали, что пролиферация НСК человека наблюдается лишь до 3-летнего возраста, а в дальнейшем в центрах нейрогенеза делятся лишь клетки нейроглии и паренхимы [5]. В 2018 г. Sorrells с соавт. опубликовали данные о том, что количество пролиферирующих НСК и молодых нейронов в зубчатой извилине резко снижается в течение первого года жизни, а к 7 годам наблюдается лишь несколько изолированных молодых нейронов. У взрослых людей не были обнаружены даже молодые нейроны в зубчатой извилине. Сходные результаты получены ими при изучении головного мозга обезьян Macaca mulatta. Была использована иммуногистохимическая техника с применением специфических антител, связывающихся с белками, характерными для определённых типов клеток (НСК, пролиферирующие и незрелые нейроны) на образцах от 59 человек [4].

Sorrells с соавт. объяснили «ложноположительные» результаты всех предшествующих работ по обнаружению нейрогенеза у взрослого человека следующим образом. По их мнению, можно получить БДУ-подобное иммуногистохимическое мечение в тканях, которые не содержат данное вещество, а белки PSA-NCAM и DCX, специфичные для незрелых нейронов, у людей могут маркировать клетки нейроглии и зрелые нейроны [4]. Противоречия в полученных данных требуют дальнейших исследований, а также пересмотра результатов различных авторов для доказательства возможности нейрогенеза взрослого человека. Перспективным направлением в данной области может стать анализ результатов молекулярно-генетических исследований. Так, изучение длинных некодирующих РНК (lncRNA) показало, что специфические для эмбрионального гиппокампа млекопитающих lncRNA [34] экспрессируются в СГЗ взрослого человека [35]. Благодаря анализу lncRNA можно не только определять переход от одной стадии дифференцировки нейрональных предшественников в другую, но также вычислять количество и тип клеток в каждой из стадий. Например, нокдаун lncRNA Six3os в НСК у взрослых мышей из СВЗ приводил к двукратному уменьшению количества клеток, позитивных по нейрональному маркеру Tuj1 и к пролиферации позитивных по GFAP. Нокдаун Dlx1as приводил к снижению экспрессии транскрипционных факторов Dlx1/2, трёхкратному снижению количества Tuj1-позитивных и увеличению на 60% – GFAP-позитивных нейробластов [36]; нокдаун lncRNA Pnky – к увеличению образования нейронов в несколько раз [37].

Таким образом, интеграция молекулярно-генетических методов в современную цитологию позволяет получить необходимые сведения для доказательства нейрогенеза в головном мозгу взрослых людей. Более того, многие lncRNA проявляют паттерны динамической экспрессии в процессах нейронально-глиальной спецификации, влияя на особенности приверженности к специфической клеточной линии. Например, истощение lncRNA lnc-OPC (oligodendrocyte precursor cell) приводит к значительному снижению экспрессии таких маркеров клеток предшественников олигодендроцитов, как CNP, MBP, PLP1, а также поверхностного маркера олигодендроцитов O4+ [38]. То есть при помощи анализа lncRNA можно не только доказать, но и охарактеризовать дифференцировку глиальных клеток и нейронов из единых предшественников. Благодаря этому можно получить неоспоримые объективные данные о специфичности пролиферирующих клеток и их принадлежности к нейронам.

Кроме того, в противовес авторам, доказывающим отсутствие нейрогенеза в головном мозгу взрослых людей, можно привести ряд работ на экспериментальных животных и людях. Так, ещё в 1993 г. Lois и Alvarez-Buylla показали, что меченные тритием (³Н-тимидином) клетки СВЗ взрослых мышей дифференцируются непосредственно в нейроны и глию в культуре эксплантов. Около 98% нейронов, образованных от эксплантов СВЗ in vitro, происходили из НСК [39]. В 2000 г. в образцах гиппокампа взрослого человека были обнаружены НСК, способные к пролиферации и дифференцировке in vitro [40]. В 2013 г. опубликованы убедительные данные о нейрогенезе в гиппокампе взрослого человека, подтверждённые использованием радиоизотопа углерода ¹⁴С. Было показано, что около 1/3 нейронов гиппокампа обновляются, составляя 1,75% всех нейронов головного мозга в год, что сопоставимо с аналогичными результатами на мышах [41]. В 2018 г. Boldrini с соавт. показали, что нейрогенез у человека сохраняется в течение всей жизни, а объём зубчатой извилины остаётся неизменным до 65-летнего возраста [42]. Seri с соавт. доказали, что клетки СГЗ, экспрессирующие GFAP, имеют характеристики астроцитов, делятся и генерируют новые нейроны в нормальных условиях in vivo, а также после химического удаления активно пролиферирующих клеток. Была описана популяция малых клеток СГЗ, названных клетками типа D, которые происходят от астроцитов и могут функционировать как временные предшественники для образования новых нейронов [43]. То есть пролиферация клеток с характеристиками нейроглии [4] может свидетельствовать об обновлении нейронов, так как НСК и нейрональные предшественники имеют характеристики астроглии при электронной и световой микроскопии, а также экспрессируют общие с астроцитами маркеры. Более того, сами астроциты (специфические субпопуляции) у взрослых млекопитающих могут функционировать в качестве первичных нейрональных предшественников или даже НСК [44]. В эксперименте отмечена способность эпендимальных клеток, выстилающих боковые желудочки, в ответ на инсульт, у мышей становиться источниками нейробластов и астроцитов [45]. Полученные данные свидетельствуют в пользу сохранения нейрогенеза у взрослых млекопитающих, в том числе и у человека, как в норме, так и при патологии.

ПЕРСПЕКТИВЫ ИССЛЕДОВАНИЯ НЕЙРОГЕНЕЗА ЧЕЛОВЕКА

Для изучения нейрогенеза в гиппокампе млекопитающих используются ретровирусные векторы, позволяющие идентифицировать образование новых нейронов и определять их функциональность. Так, в работе van Praag с соавт. был использован вектор, экспрессирующий флуоресцентный белок, маркирующий только делящиеся клетки. В результате было показано, что вновь возникшие клетки в гиппокампе взрослых мышей имеют морфологию и функциональные свойства нейронов [46]. Так как имеется сходство нейрогенеза в гиппокампе человека и грызунов сопоставимого возраста [9], полученные данные могут служить доказательством пролиферации НСК взрослых людей. Имеется тесная взаимосвязь между вирусами и транспозонами. Предполагается, что ретровирусы произошли в эволюции от LTR-ретроэлементов Ty3/Gypsy [47]. В отношении нейрогенеза данное обстоятельство имеет большое значение, так как неокортекс эволюционировал благодаря неавтономному транспозону MER130 [48]. Кроме того, был выявлен феномен обмена нейронов информацией при помощи вирусоподобных частиц с использованием белка Arc, произошедшего в эволюции от ретроэлементов Ty3/Gypsy [49].

Транспозоны представляют собой мобильные генетические элементы и подразделяются на два класса: ДНК-транспозоны и ретроэлементы (РЭ). Первые составляют около 3% генома человека и перемещаются с помощью механизма «вырезание и вставка». РЭ функционируют путём «копирования и вставки» и классифицируются на содержащие длинные концевые повторы (LTR) и не содержащие их (non-LTR) [50]. Накопленные в литературе данные позволяют предположить, что транспозоны являются основными координаторами реализации эпигенетической программы онтогенеза [51]. Для головного мозга это разрешает вопрос огромного многообразия фенотипов нейронов в различных его структурах, так как транспозоны способны к неограниченному количеству рекомбинаций генетической информации. Было доказано, например, что благодаря транспозонам возникла V(D)J рекомбинация, подобно которой использование РЭ в клетках нервной системы может обеспечить их бесчисленным разнообразием фенотипов [52]. Кроме того, РЭ оказались основными источниками lncRNA [53, 54] и могут даже непосредственно служить в качестве их генов [55, 56] с тканеспецифическим характером экспрессии. Полученные данные о роли lncRNA в дифференцировке нейронов [36–38] могут отражать сложную систему управления данным процессом при помощи последовательных перемещений транспозонов. Этим можно объяснить выраженный инсерционный мозаицизм геномов нейронов различных структур головного мозга и транспозиционную активность НСК в гиппокампе человека [57], обусловленные необходимыми перемещениями для управления дифференцировкой клеток [58, 59]. Данные процессы могут отражать паттерн регуляторной настройки генома при возникновении новых клеток начиная с первого деления зиготы [60]. Например, согласно результатам секвенирования транскриптома и биоинформационных анализов, было показано, что значительное количество транскриптов в 2-клеточной стадии эмбриогенеза мышей инициируются из LTR-содержащих РЭ. Это говорит о роли транспозонов в регуляции дифференцировкой всех клеток организма [61]. Соответственно, активность РЭ может свидетельствовать о пролиферативном потенциале клеток и служить доказательством наличия нейрогенеза у взрослого человека. Было доказано, например, что LINE-1, относящиеся к non-LTR РЭ, способствуют соматическому мозаицизму нейронов, влияют на формирование сети головного мозга, приводя к изменениям поведенческих и познавательных функций [50]. Таким образом, перспективным направлением в изучении механизмов дифференцировки различных клеток головного мозга может служить исследование транспозонов и образуемых из их транскриптов lncRNA.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ / ADDITIONAL INFO

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Author contribution. All authors confirm the compliance of their authorship, according to international ICMJE criteria (all authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published).

About the authors

Rustam N. Mustafin

Bashkir State Medical University

Author for correspondence.
Email: ruji79@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4091-382X
SPIN-code: 4810-2535

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, 3, Lenin Street, Ufa, 450008

Elza K. Khusnutdinova

Bashkir State Medical University

Email: elzakh@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2987-3334
SPIN-code: 7408-9797

Dr. Sci. (Biol), Professor, Corresponding Member of the Russian Academy of Education, Academician of the Academy of Sciences of the Republic of Bashkortostan

Russian Federation, 3, Lenin Street, Ufa, 450008

References

Supplementary files