LOCALIZATION AND QUANTITATIVE ASSESSMENT OF OXYGEN-DEPENDENT HYPOXIA-INDUCIBLE FACTOR 1α IN THE BRAIN OF MITTEN CRAB ERIOCHEIR JAPONICA IN NORM AND IN ACUTE ANOXIA (AN IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY)

Full Text

В регуляции кислородного гомеостаза важная механизмах нейропротекции при гипоксии/ишероль принадлежит семейству высококонсерватив-мии и оксидативном стрессе [4, 11, 15]. Недавние ных транскрипционных факторов - факторов, исследования показали, что гипоксия стимулииндуцируемых гипоксией (HIF). Ключевую роль рует экспрессию HIF-1α и в ряде органов бесв этом процессе, как теперь установлено, игра-позвоночных [7, 8, 12]. В ЦНС беспозвоночных ет кислородчувствительный транскрипционный подобные исследования проводились только биофактор HIF-1α [11, 17, 19]. Имеются доказатель-химическими методами, не позволяющими судить ства, что HIF-1α у млекопитающих участвует в о распределении таких клеток в отдельных структурах мозга [9]. Вместе с тем, сведения о топографии и численности HIF-1α-позитивных клеток в мозгу имеют принципиальное значение для понимания механизмов формирования толерантности к гипоксии у разных классов и видов животных, в том числе у японского мохнаторукого краба Eriocheir japonica, который отличается исключительной способностью приспосабливаться к различным экстремальным воздействиям, включая гипоксию. Цель настоящей работы заключалась в изучении локализации и количественной оценке содержания фактора HIF-1α в клетках мозга краба E. japonica в норме и при острой аноксии. Материал и методы. Работа выполнена на половозрелых мужских особях мохнаторукого краба Eriocheir japonica с шириной карапакса 61-62 мм, отловленных в заливе Петра Великого (Японское море) в апреле 2013 г. После адаптации в течение нескольких суток животных разделяли на 2 группы. Контрольную группу из 5 крабов содержали в аквариуме с аэрируемой морской водой при температуре 20 ºС, экспериментальную - экспонировали в условиях аноксии, вызванной депривацией воды в течение 2, 4, 6 и 12 ч (по 5 животных) при 20 ºС по описанной ранее методике [5]. При работе с гидробионтами руководствовались Директивой 86/609/ЕЕС Совета ЕС от 24 ноября 1986 г. Для вестерн-иммуноблоттинга свежевыделенные образцы мозга гомогенизировали в соотношении 1:5 в буфере следующего состава: 20 мМ трис-HCl (pH 7,5), 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), 0,5 мМ дитиотреитола (DTT), 0,2 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF). После центрифугирования (15 000 g при 4 ºС, 20 мин) супернатант отделяли и определяли в нем концентрацию общего белка. Электрофорез белков проводили в 12% полиакриламидном геле. Количество общего белка, вносимого в лунки для электрофореза, составляло 40 мкг. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Santa Cruz Biotechnology, Inc). Для блокирования неспецифического связывания антител мембрану инкубировали в трис-HClбуфере, содержащем 4% бычий сывороточный альбумин, в течение ночи. Иммунодетекцию проводили моноклональными антителами мыши к HIF-1α (разведение 1:1000; Abcam, Великобритания) 3 ч при 4 ºС, а затем вторичными, конъюгированными с пероксидазой хрена (Vector Labs, США). Для визуализации пероксидазной реакции использовали VIP Substrate Kit (Vector Labs, США). Затем мембраны промывали и сканировали. Для иммуногистохимического выявления HIF-1α мозг крабов фиксировали 2 чв 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2) при 4 ºС. Получали криостатные срезы толщиной 30 мкм. HIF-1α выявляли на серийных срезах головного ганглия с помощью метода непрямого авидин-биотин-пероксидазного маркирования. После ингибирования эндогенной пероксидазы в 1% растворе H2O2 и подавления неспецифического связывания антител в 1% нормальной сыворотке лошади срезы инкубировали в течение 18 ч при 4 ºС с моноклональными антителами мыши к HIF-1α (разведение 1:500; Abcam, Великобритания). Затем срезы промывали в нескольких сменах 0,1 М фосфатно-солевого буфера (PBS) (pH 7,2) и инкубировали 2 ч в растворе вторичных биотинилированных антител (Vector Labs, США) в разведении 1:200. После отмывания срезы инкубировали в течение 1 ч с авидинбиотин-пероксидазным комплексом (Vectastain Elite АВС Kit, Vector Labs, США) при температуре 22-24 ºС в темноте, после чего их трижды промывали в PBS. Продукты реакции выявляли при помощи субстрата (VIP Substrate Kit, Vector Labs, США), контролируя процесс окраски под микроскопом. Затем срезы промывали в трех сменах PBS, обезвоживали по стандартной методике и заключали в бальзам. Возможность применения моноклональных антител мыши к HIF-1α для идентификации этой молекулы в различных органах и тканях беспозвоночных, в том числе в мозгу ракообразных, доказана результатами выполненных ранее молекулярно-генетических и биохимических исследований [7, 9, 12, 17]. У всех животных мозг изучали в пределах границ клеточных групп 6, 9/11, 17, топографию которых уточняли по данным D. C. Sandeman и соавт. [13]. Исследование проводили на серии последовательных срезов, один из которых обрабатывали 0,5% раствором метиленового синего для определения общего количества нейронов, каждый второй - использовали для иммуногистохимического исследования. Препараты просматривали под микроскопом Axiovert 200М (Zeiss, Германия). Подсчитывали число и определяли размеры нейронов на монтажах срезов, сформированных программой AxioVision 4.8, только в тех клеточных группах ганглия, в которых иммунопозитивные нейроны выявлялись постоянно и в достаточном количестве для статистического анализа. При этом учитывали только те нейроны, которые имели отчетливо видимое ядро. Для оценки специфичности реакции проводили обработку срезов без первичных или вторичных антител. На контрольных срезах иммунопозитивная реакция отсутствовала. Для количественного анализа нейронов использовали пакет компьютерных программ автоматизированной системы анализа изображений Allegro-MC. Определяли долю маркированных клеток от общего числа нейронов в каждой клеточной группе, учитывая только те нейроны, плотность окраски которых была выше окраски фона не менее 1,5 раз. Количественные результаты, полученные при обработке не менее 10 серийных срезов ганглия от каждого исследуемого животного, представляли в виде среднего значения и его стандартной ошибки. Их различия оценивали по t-критерию Стьюдента и считали значимыми при Р<0,05. Результаты исследования. Методом вестерн-иммуноблоттинга в тотальном белковом экстракте мозга как у интактных крабов Eriocheir japonica, так и после аноксии, вызванной депривацией воды, выявляется полипептидный антиген с молекулярной массой около 116 килодальтон, перекрестно реагирующий с антителами к HIF-1α мыши (рис. 1). Иммуноцитохимическое исследование мозга интактных крабов показало наличие HIF-1αв клеточных группах 6 и 9/11. В группе 17 нейроны, экспрессирующие HIF-1α, постоянно не выявляются. Большинство иммунопозитивных клеток имеют овальную, грушевидную или полигональную форму, относительно крупные размеры (около 800 мкм2) и невысокую интенсивность реакции (рис. 2, а). Однако плотность отложения преципитата существенно повышается в мелких нейронах площадью тела 70-250 мкм2. Как правило, они имеют округлую и грушевидную форму, крупное ядро и узкий ободок цитоплазмы. Подсчеты показали, что доля HIF-1α-позитивных нейронов наиболее высока в клеточной группе 6, но и в ней величина показателя не превышает 4% от общего числа клеток, выявленных в этой группе окраской метиленовым синим (рис. 3, а). Еще ниже доля иммунопозитивных нейронов в клеточной группе 9/11 (Р≤0,05). При аноксии во всех клеточных группах мозга наблюдается значимое увеличение доли иммунопозитивных нейронов. Вместе с тем, динамика количественных преобразований нейронов, экспрессирующих HIF-1α в исследованных группах, имеет существенные различия. В клеточной группе 6 уже через 2 ч аноксии наблюдается резкое увеличение доли таких нейронов, а через 6 ч их относительное содержание достигает максимальных цифр, снижаясь к 12 ч эксперимента (см. рис. 3, б). Особенно существенно в указанной группе возрастет количество клеток, содержащих HIF-1α, в центральной части дорсальной поверхности и переднемедиальной части вентральной поверхности мозга. При этом увеличение значений показателя происходит, преимущественно, за счет мелких нейронов, многие из которых отличаются высоким уровнем экспрессии HIF- 1α (см. рис. 2, б). Однако, начиная с 4 ч, прирост доли нейронов обеспечивается и более крупными клетками, в части которых наблюдается повышение плотности продукта реакции (см. рис. 2, в). В клеточной группе 9/11 изменение значений доли иммунопозитивных нейронов имеет другую динамику (см. рис. 3, б). К 4 ч аноксии наблюдается значительное увеличение доли иммунопозитивных клеток, а затем постепенное её снижение. В этой группе прирост числа HIF-1α-позитивных нейронов не столь значителен, как в предыдущей группе, и происходит примерно в равной степени за счет мелких и крупных нейронов. В клеточной группе 17 иммунопозитивные нейроны постоянно выявляются через 2 ч аноксии. Как правило, это клетки округлой или полигональной формы с площадью тела от 600 до 900 мкм2, расположенные, преимущественно, в каудальной части вентральной поверхности мозга. Хотя их количество в этот период невелико, к 4 ч оно существенно возрастает, к 6 ч - вновь сокращается, а после 12 ч аноксии HIF-1α-позитивные нейроны в этой группе не выявляются. Вместе с тем, к 6 ч аноксии экспрессия HIF-1α появляется в многочисленных мелких (площадью 50-70 мкм2) гемоцитоподобных клетках, лежащих в основном по ходу сосудов в области медиального антеннулярного нейропиля (рис. 2, г). Обсуждение полученных данных. Представленные материалы свидетельствуют, что фактор, индуцированный гипоксией HIF-1α, определяется в мозгу у краба Eriocheir japonica как в обычных условиях жизнедеятельности организма, так и при экспериментальном воздействии. В мозгу методом вестерн-иммуноблоттинга нами показано присутствие полипептидного антигена с молекулярной массой 116 килодальтон, перекрестно реагирующего с антителами к HIF-1α мыши. Экспрессия этого белка в последние годы установлена во многих органах и тканях у позвоночных и беспозвоночных животных [7, 10, 17], однако в ЦНС ракообразных наличие HIF-1α показано исключительно биохимическими методами [9]. При изучении распределения нейронов, содержащих HIF-1α в нескольких клеточных группах мозга у краба E. japonica, обнаружено, что у интактных животных экспрессия наблюдается в небольшом количестве нейронов головного ганглия и существенно возрастает в некоторых участках мозга при аноксии, вызванной депривацией воды. Вполне вероятно, что увеличение концентрации HIF-1α в нейронах экспериментальной группы животных связано с его нейропротективным действием. Недавно было показано, что повышение уровня экспрессии HIF-1α в клетках мозга у крыс защищает их от гибели, вызванной кислородным голоданием [11, 18]. Выявлена зависимость концентрации HIF-1α от тяжести и длительности гипоксии: при непродолжительном и умеренном ее действии наблюдается быстрое и значительное повышение содержания HIF-1α в мозгу, в результате чего запускается каскад нейропротективных механизмов, защищающих нейроны, макро-и микроглию, эндотелий сосудов мозга от повреждений, вызванных кислородным голоданием [11, 15, 18]. При хронической и тяжелой гипоксии экспрессия HIF-1α в мозгу у крыс снижается за счет увеличения скорости его деградации и апоптоза нейронов [4, 18]. В ЦНС у морских беспозвоночных механизмы активации HIF-1α и его роль в формировании толерантности к гипоксии мало изучены. Нам известна лишь одна такая работа, в которой приводятся материалы об усилении экспрессии HIF- 1α в мозгу рака богомола (Oratosquilla oratoria) при хронической гипоксии, вызванной антропогенным загрязнением среды обитания [9]. Вместе с тем, имеются сообщения об изменениях содержания этой сигнальной молекулы при гипоксии в других органах и тканях морских беспозвоночных [7, 8, 12]. Активация HIF-1α при гипоксии обычно сопровождается экспрессией генов, регулирующих энергетический обмен [10, 12, 17]. В отличие от позвоночных обязательным условием выживания у беспозвоночных при гипоксии является снижение общего уровня потребления аденозинтрифосфата за счет метаболической депрессии, связанной с изменениями белкового обмена [6, 19]. Однако не все нейроны уменьшают свои метаболические потребности при гипоксии в равной степени. У некоторых видов позвоночных, устойчивых к гипоксии, например окрашенной черепахи, большая часть нейронов мозга при ограниченном поступлении кислорода резко сокращают свои метаболические потребности, другие нейроны, контролирующие критические функции организма, необходимые для его выживания, не только не сокращают, но, наоборот, наращивают свой метаболический потенциал, действуя аналогично центральным хемосенсорам кислорода у млекопитающих [3]. В этих, по авторской терминологии, «бдительных» нейронах, которые особенно важны как для краткосрочных, так и долгосрочных адаптаций к гипоксии, уровень экспрессии HIF-1α особенно высок. По нашим данным, у E. japonica такие нейроны находятся, прежде всего, в группе 6, клетки которой играют важную роль в интегративных процессах ЦНС, в частности, в формировании двигательных программ поведения в экстремальных ситуациях [16]. Уже после 2-часовой аноксии в этой клеточной группе резко увеличивается число иммунопозитивных нейронов, достигая максимума через 6 ч экспериментального воздействия. Некоторые из этих нейронов отличаются очень высоким уровнем экспрессии HIF-1α. Между 2-4 ч аноксии возрастает, хотя и не так значительно, число HIF-1α-позитивных нейронов и в группе 9/11, где находятся клетки, участвующие в обработке мультимодальной информации, поступающей в мозг [14]. Известно, что у млекопитающих экспрессия HIF-1α в нейронах во многом обеспечивает быстрые и адекватные ответы на гипоксический стресс стимуляцией центров дыхания и вазомоторики, а также включением генов, отвечающих за энергетический метаболизм, ангиогенез и апоптоз, повышая устойчивость к гипоксии [18]. В клеточной группе 17, участвующей в иннервации внутренних органов краба, количество HIF-1α-позитивных нейронов повышается к 4 ч аноксии, но затем быстро сокращается. После 6-часовой аноксии доля HIF-1αпозитивных нейронов во всех клеточных группах сокращается (в группе 17 в этот период они не определяются), но HIF-1α появляется в гемоцитах. Недавно представлены доказательства того, что у ракообразных гемоциты обладают свойствами стволовых клеток [1, 2]. При различных экстремальных воздействиях, в том числе при гипоксии, они могут мигрировать из органов иммунной системы - места своего образования - в мозг, где при сокращении числа нейронов формируют популяцию клеток-предшественников, способных восполнить дефицит нейронов. Таким образом, в мозгу краба E. japonica имеются, по крайней мере, две популяции клеток, экспрессирующих HIF-1α: нейроны и гемоциты. С их помощью фактор HIF-1α может участвовать в реализации центральных механизмов регуляции кислородного гомеостаза при адаптации к краткосрочной и долгосрочной гипоксии путем изменения метаболизма и локомоторных поведенческих реакций. Гемоциты не только обеспечивают более высокий уровень содержания HIF-1α в мозгу, способствуя усилению нейропротекции, но и, возможно, восполняют часть нейронов, утраченных в процессе развития хронической гипоксии.

About the authors

V. M. Chertok

Vladivostok State Medical University

Email: chertokv@mail.ru
Department of Human Anatomy

Ye. P. Kotsyuba

A. V. Zhirmunskiy Institute of Marine Biology

Email: epkotsuba@mail.ru

References

Supplementary files