BELOK KLETOChNYKh KONTAKTOV BETA-KATENIN V KLETKAKh EPENDIMY I EPITELIYa SOSUDISTOGO SPLETENIYa BOKOVYKh ZhELUDOChKOV GOLOVNOGO MOZGA

Full Text

Клеточные контакты являются важным компонентом сложного надмембранного и подмембранного комплекса структур, который позволяет организовать группы клеток в пласты. Это характерно, в первую очередь, для эпителиальных тканей. В формировании различных типов контактов принимают участие определенные группы белков. Бета-катенин входит в состав комплекса, необходимого для скрепления мембран соседних клеток и стабилизации их цитоскелета с образованием единой жесткой системы [9]. В головном мозгу пласты образованы клетками эпендимы, выстилающими желудочки головного мозга, и клетками, покрывающими сосудистое сплетение. Вопрос о тканевой принадлежности этих клеток является одним из дискуссионных. Несмотря на то, что они развиваются из одного эмбрионального зачатка (нервной трубки), существует мнение, что клетки сосудистого сплетения истинно эпителиальные [2], в отличие от клеток эпендимы желудочков головного мозга и центрального канала спинного мозга. В отечественной гистологической терминологии клетки, покрывающие сосудистое сплетение, именуются эпендимоцитами (эпендимными клетками) сосудистого сплетения [4]. В зарубежной литературе чаще эти клетки называют эпителием сосудистого сплетения [6]. В настоящее время в работах, посвященных постнатальному нейрогенезу [5], реакция на бетакатенин нередко используется для выявления границ клеток эпендимы, но фундаментальные гистологические исследования тканевой организации циркумвентрикулярных органов головного мозга с использованием этого маркера ранее не проводились. В связи с этим целью настоящего исследования было изучение характера распределения бета-катенина в сосудистом сплетении и эпендиме боковых желудочков головного мозга. Материал и методы. Исследовали головной мозг взрослых, половозрелых крыс линии Вистар (n=10). При содержании и умерщвлении животных руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.). Материал фиксировали в цинкэтанол-формальдегиде [3]. Обезвоженные объекты заливали в парафин по общепринятой методике. Морфологическому исследованию подвергали фронтальные срезы конечного мозга. Для иммуноцитохимического выявления бетакатенина были использованы поликлональные кроличьи антитела (Abcam, Великобритания) в разведении 1:100 и набор Reaveal Polyvalent HRP DAB Detections System (SpringBioscience, США). Визуализацию продукта иммуногистохимической реакции проводили при помощи хромогена диаминобензидина (DAB+, Dako, Дания). После проведения реакции часть срезов докрашивали квасцовым гематоксилином. Фотосъемку проводили с помощью микроскопа Leica DM750 и фотокамеры ICC50 (Leica, Германия). Для флюоресцентного выявления бета-катенина были использованы биотинилированные вторичные антитела из набора Cell and Tissue Staining Kit (rabbit Kit) HRP-DAB System («R&D»Systems, США) и конъюгаты стрептавидина с карбоцианином (Cy2, Jackson ImmunoResearch, США) или с индокарбоцианином (Cy3, Invitrogen, США). Ядра клеток докрашивали флюоресцентным красителем TO-PRO3 (1:300) из набора SelectFX (Invitrogen, США). Обработку полученных изображений и трехмерную реконструкцию проводили с применением конфокального микроскопа LSM710 (лазеры с длиной волны 488 и 633 нм) и компьютерной программы ZEN 2011(Carl Zeiss, Германия). Исследование выполнено с использованием оборудования, предоставленного в соответствии с программой «Протеом человека» РАН. Результаты исследования. После проведения иммуногистохимической реакции на бета-катенин положительная реакция различной степени интенсивности была обнаружена в клетках эпендимы, сосудистого сплетения, отростках и телах клеток субвентрикулярной зоны и рострального миграционного потока, эндотелии кровеносных сосудов, клетках мягкой оболочки мозга, нейропиле стриатума и неокортексе. Наиболее интенсивная реакция была в эпендиме и сосудистом сплетении (рис. 1). В эпендиме наблюдалась ячеистая структура, которая соответствовала зоне клеточных границ с усилением интенсивности в апикальной области эпендимоцитов. В перинуклеарной цитоплазме и ядре последних бета-катенин не определялся (см. рис 1, а). В эпителиоцитах сосудистого сплетения продукта иммуноцитохимической реакции было больше, чем в эпендиме. Он располагался вблизи предполагаемых границ латеральных и базальных поверхностей клеток и отсутствовал со стороны апикальной поверхности (см. рис. 1, б). В перинуклеарной цитоплазме и в ядре клеток реакция также отсутствовала. В стромальном компоненте сосудистого сплетения бета-катенин не определялся. Использование конфокальной лазерной микроскопии и построение трехмерных реконструкций позволяют изучать исследуемые объекты в различных проекциях. Установлено, что значительное (почти все) количество бета-катенина располагалось рядом с межклеточной границей в верхней трети латеральной поверхности эпендимоцитов (рис. 2, а, б). Он распределялся по границе клеток в виде опоясывающего кольца и, поскольку клетки соединились друг с другом, то общая картина напоминала пчелиные соты при отсутствии отчетливой гексагональной организации (см. рис. 2, а). Со стороны желудочка на поверхности эпендимы обнаруживались области концентрации бета-катенина вокруг небольших иммунонегативных зон (см. рис. 2, а). В цитоплазме эпендимоцитов и субэпендимном слое присутствовал мелкозернистый продукт иммуноцитохимической реакции. В клетках эпителия сосудистого сплетения при больших увеличениях конфокального лазерного микроскопа, так же как и при световой микроскопии, было видно, что реакция на бетакатенин локализуется на границе между клетками и вблизи границы клеток с базальной мембраной (см. рис. 2, в). Высокое разрешение изображения, которое можно получить с помощью конфокального лазерного микроскопа при толщине оптического среза 0,2 мкм, позволяет наблюдать неравномерное распределение бета-катенина в базальной части, которое занимает широкую зону (до 1-2 мкм) и иногда напоминает картину, характерную для базальной складчатости. Обсуждение полученных данных. В результате настоящего исследования было обнаружено, что характер распределения бетакатенина в эпендиме и сосудистом сплетении различен при сопоставимой интенсивности реакции в обеих структурах. В эпендимоцитах продукт реакции обнаруживается в области апикальной части их латеральной поверхности, что согласуется с данными о локализации опоясывающих десмосом (zonulae adherentes) в эпителиальных тканях [8], которые играют важную роль в определении полярности клеток. Характер распределения бета-катенина кажется различным при изучении объекта в разных плоскостях. При исследовании бета-катенина в эпендиме на фронтальных срезах с помощью микроскопии в проходящем свете видно, что продукт реакции занимает всего лишь небольшую зону у апикальной поверхности клетки. Однако при наблюдении эпендимы со стороны поверхности желудочков видно, что продукт реакции распределен по всему периметру клеток, поэтому их границы хорошо прослеживаются. В ряде работ, посвященных изучению нейральных стволовых клеток в составе эпендимы, бета-катенин используется для определения клеточных границ [5]. Вследствие сказанного выше возникает вопрос о том, подходит ли реакция на бета-катенин для определения границ клеток эпендимы. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что не во всех плоскостях можно четко визуализировать границы клеток. Если при изготовлении препарата фронтальный срез прошел строго перпендикулярно продольной оси мозга, можно видеть только точки соприкосновения клеток в апикальной зоне, если же срез получился тангенциальный, то вероятность определения клеточных границ повышается. При построении пространственных реконструкций границы между клетками очень хорошо прослеживаются со стороны полости желудочка и неопределимы в боковой проекции. В отличие от эпендимы, в сосудистом сплетении бета-катенин более равномерно распределен по базальной и латеральной границам клеток. Сходное распределение этого белка наблюдается в эпителиоцитах проксимальных и дистальных канальцев почки [7]. Обращает на себя внимание факт накопления бета-катенина в базальных отделах покровных клеток сосудистого сплетения и эпителиоцитах проксимальных извитых канальцев почки [7]. Такое сходство распределения бета-катенина может быть объяснено необходимостью дополнительной механической стабилизации в области базальной складчатости этих эпителиальных клеток, а также участием бета-катенина в прикреплении клеток эпителия к базальной мембране. Отсутствие скопления бета-катенина в базальной части эпендимоцитов можно объяснить неровностями базальной поверхности, от которой отходят отростки [1], фиксирующие эпендимный пласт к подлежащим структурам без участия специализированных межклеточных контактов, и отсутствием у эпендимоцитов базальной мембраны. Таким образом, различия в распределении бета-катенина в эпендиме и покровных клетках сосудистого сплетения свидетельствуют о сравнительно большей близости последних к клеткам типичных эпителиальных тканей, что нельзя сказать об эпендиме. В связи с этим вопрос о тканевой принадлежности эпендимы и ее производных - эпителиоморфных клетках циркумвентрикулярных органов - нуждается в дальнейшем прояснении.

About the authors

O. V. Kirik

RAS Research Institute of Experimental Medicine

Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

D. A. Sufieyva

RAS Research Institute of Experimental Medicine

Email: rondo-13@mail.ru
Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

A. V. Nazarenkova

RAS Research Institute of Experimental Medicine

Email: phucus@mail.ru
Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

D. E. Korzhevskiy

RAS Research Institute of Experimental Medicine; St. Petersburg State University

Email: iemmorphol@yandex.ru
Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology; Department of Fundamental Problems of Medicine and Medical Technology

References

Supplementary files