ЕXPRESSION OF DOUBLECORTIN AND NeuN IN THE DEVELOPING CEREBELLAR NEURONS IN RAT

Full Text

Молекулярные маркеры все шире используются для оценки развития головного мозга в онтогенезе у животных и человека [2-4]. Даблкортин (Doublecortin, DCX) представляет собой белок, ассоциированный с микротрубочками цитоскелета нейронов позвоночных, который экспрессируется незрелыми нейронами перед и во время миграции в период развития мозга. Позднее он выявляется в растущих отростках нейронов [7]. DCX экспрессируется и в щеточных нейронах вестибулоцеребеллума у взрослых крыс и играет определенную роль в синооптической пластичности этих клеток [13]. NeuN (neuronal nuclear antigen) - нейрональный ядерный антиген, который экспрессируется в ядрах и перинуклеарной цитоплазме большинства зрелых нейронов ЦНС и не определяется в незрелых нервных клетках. NeuN не экспрессируется в клетках Пуркинье и нейронах зубчатого ядра мозжечка, а также в глиальных клетках [12]. В коре развивающегося мозжечка у крыс, наряду с обычным, «внутренним» зернистым слоем (ВЗС), существует дополнительный, наружный зернистый слой (НЗС), где пролиферация клеток продолжается в постнатальный период. НЗС мозжечка образуется у 17-суточного зародыша в результате первой волны миграции к наружной поверхности развивающегося мозжечка из дорсальной части нервной трубки, называемой ромбовидной губой, расположенной на границе среднего и заднего мозга [16]. НЗС является герминативной зоной, состоящей из 3-6 рядов предшественников зернистых нейронов [10]. При этом 1-3 наружные ряда образуют пролиферирующие клетки, которые после последнего митоза вытесняются во внутренние ряды НЗС, принимают веретеновидную форму и начинают радиальную миграцию в область будущего ВЗС [11]. НЗС наибольшего развития достигает к 7 сут, и между 7-15-ми сутками постнатального развития образуются большинство зернистых нейронов, формирующих ВЗС, ак 20-21-м суткам постнатальной жизни у крыс НЗС исчезает. В ряде исследований установлено, что миграционное поведение зернистых клеток обусловлено генетической программой [17], а также влиянием микроокружения, активацией специфических рецепторов N-метил D-аспарагиновой кислоты (NMDA), полимеризацией и распадом микротрубочек, создающих тянущую и толкающую силу для перемещения ядра и цитоплазмы [14]. Цель настоящего исследования - сравнительная оценка динамики экспрессии DCX и NeuN в нейронах коры древней, новой частей и промежуточного ядра мозжечка у крыс в раннем постнатальном онтогенезе. Материал и методы. Эксперименты проведены на 5 самках беспородных белых крыс с исходной массой 180±20 г и родившемся от них потомстве. Все опыты выполнены с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» [1]. На данное исследование получено разрешение комитета по биомедицинской этике Гродненского государственного медицинского университета (протокол № 7 от 23.12.2013 г.). Животные находились на стандартном рационе вивария. От каждой самки брали по одному крысенку по достижении ими 2-, 7-хи 15-х суток после рождения и декапитировали. Для получения сопоставимых результатов образцы мозжечка от всех животных обрабатывали параллельно и в одинаковых условиях. Их фиксировали в цинк-формалине при 4 ºС (в течение ночи), а затем обычным способом заливали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм готовили с помощью микротома LeicaRM 2125 RTS (Leica, Германия). Для иммуногистохимического выявления DCX применяли первичные поликлональные кроличьи антитела (Abcam, Великобритания) ab.18723, для NeuN - ab.128886 (в разведении 1:400, при 4 ºС, 20 ч, во влажной камере). Для выявления связавшихся первичных антител использовали набор EXPOSE Rabbit specific HRP/DAB detection IHC kit ab.80437Abcam (Великобритания). Соседние срезы окрашивали 0,1% раствором тионина по методу Ниссля. В филогенетически древней и новой частях мозжечка измеряли толщину НЗС и ВЗС коры. Их расположение на гистологических препаратах развивающегося мозжечка определяли по описаниям С. Н. Оленева [5]. Измеряли оптическую плотность осадка хромогена в DCX-иммунопозитивных нейронах НЗС, NeuN-иммунопозитивных нейронах ВЗС и промежуточного ядра мозжечка. Во ВЗС определяли плотность расположения NeuN-иммунопозитивных нейронов на 1000 мкм2. Изучение гистологических препаратов, их микрофотографирование и морфометрию проводили с помощью микроскопа Axioscop 2 plus (Zeiss, Германия), цифровой видеокамеры LeicaDFC 320 (Leica, Германия) и программы анализа изображения ImageWarp (Bitflow, США). Для каждого показателя определяли значения медианы и интерквартильного диапазона (Ме±IQR). Различия сравниваемых величин оценивали по U-критерию Манна-Уитни и считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. На 2-е сутки после рождения в НЗС коры мозжечка в 2-3 наружных рядах, где находятся делящиеся клетки, DCX-иммунопозитивные нейроны отсутствовали (рисунок, а). Интенсивная экспрессия DCX определялась в 2-3 внутренних рядах клеток НЗС, где располагаются постмитотические зернистые нейроны, готовящиеся к радиальной миграции (см. рисунок, а; табл. 1). В последних экспрессия NeuN еще отсутствовала, но она появлялась в мигрирующих зернистых нейронах, достигая максимума в более зрелых нейронах ВЗС (см. рисунок, б). На 7-е сутки постнатального онтогенеза, когда НЗС достигал максимальной толщины (табл. 2), в его постмитотических нейронах, готовящихся к миграции, иммунореактивность DCX снизилась (см. табл. 1). Экспрессия DCX возросла в мигрирующих нейронах и разрастающихся отростках нейронов ВЗС (см. рисунок, в). В НЗС экспрессия NeuN была низкой, но увеличивалась в мигрирующих нейронах, достигая максимума в более зрелых нейронах, завершивших миграцию во ВЗС (см. рисунок, г). На 15-е сутки после рождения толщина НЗС становилась в 2 раза меньше, чем на 7-е сутки (см. табл. 2). В этот период в нейронах, готовящихся к миграции, экспрессия DCX еще больше снижалась. Она выявлялась в мигрирующих зернистых нейронах, но уже отсутствовала в телах нейронов ВЗС. Однако в его нейропиле (вероятно, растущих отростках зернистых нейронов) интенсивность реакции на DCX была довольно высокая (см. рисунок, д). В этот срок умеренная экспрессия NeuN выявлялась в мигрирующих зернистых нейронах и достигала максимума в телах нейронов ВЗС. В нейропиле этого слоя NeuN-иммунореактивность не выявлялась (см. рисунок, е). Таким образом, экспрессия DCX в предмиграционных нейронах НЗС коры в древней и новой частях мозжечка постепенно снижалась со 2-х по 15-е сутки постнатального онтогенеза. В новой части мозжечка 2-и 7-суточных крысят экспрессия DCX была больше, чем в древней, но уже к 15-суточному возрасту не отличалась от таковой в древней части мозжечка (см. табл. 1). Со 2-х по 15-е сутки постнатального онтогенеза у крыс плотность расположения NeuNиммунопозитивных нейронов во ВЗС прогрессивно увеличивалась (в 3-4 раза), при этом в них возрастала (в 2-2,5 раза) экспрессия NeuN (см. табл. 2). При сравнении коры древней и новой частей мозжечка выявлено некоторое запаздывание в нарастании экспрессии NeuN в новой его части по сравнению с таковой в древней (см. табл. 2). На 15-е сутки после рождения в новой части мозжечка НЗС был значимо толще, а ВЗС несколько тоньше, чем в древней части (табл. 3). Клетки Пуркинье (КП) у 2-суточных крысят располагались в несколько рядов, а к 7-м суткам они выравнивались, образуя монослой. Экспрессия белка DCX в КП не выявлялась на 2-е сутки после рождения. Экспрессия DCX в нейронах промежуточного ядра мозжечка на 2-, 7-еи 15-е сутки постнатального развития не выявлялась. Это свидетельствует о том, что ко 2-м суткам постнатального онтогенеза миграция этих нейронов уже была завершена, и идет процесс их дифференцировки, что сопровождается прогрессивным возрастанием в них экспрессии NeuN (см. табл. 2). Обсуждение полученных данных. Одновременное сравнительное иммуногистохимическое исследование пары молекулярных маркеров DCX и NeuN может быть удобным подходом для изучения динамики развития нейронов мозжечка у крысы в раннем постнатальном онтогенезе. Показано, что DCX отсутствует в митотически делящихся клетках НЗС, начинает выявляться в постмитотических нейронах, готовящихся к миграции, и не обнаруживается в телах нейронов, завершивших миграцию и дифференцирующихся. Это соответствует данным литературы о появлении DCX в нейронах, готовящихся к миграции, и отсутствии его в телах зрелых нейронов [15]. DCX участвует в стабилизации микротрубочек, необходимых для миграции нейронов [8], также для формирования новых отростков, и может иметь значение для синаптогенеза нейронов ВЗС. Возрастание DCX в нейропиле зернистого слоя на 7-15-е сутки совпадает с периодом интенсивного роста отростков нейронов и синаптогенеза в коре мозжечка [9]. Напротив, в незрелых постмитотических нейронах НЗС экспрессия NeuN очень низкая, но прогрессивно нарастает в мигрирующих и особенно созревающих нейронах ВЗС, что соответствует данным литературы [12]. Изменения, происходящие с КП и, в частности, образование ими монослоя к 7-м суткам, вероятно, обусловлено механическими факторами: давлением утолщающегося зернистого слоя снизу и барьером, образованным параллельными волокнами сверху, препятствующими проникновению перикарионов КП в молекулярный слой. Этот процесс не сопровождается транслокацией ядра и перестройкой цитоскелета [6]. То, что экспрессия белка DCX в КП не выявлялась даже на 2-е сутки после рождения, свидетельствует о том, что миграция КП к этому сроку завершена. Однако экспрессии NeuN в раннем постнатальном онтогенезе в КП мозжечка также не выявляется, что соответствует данным литературы [12]. Поскольку у 2-суточных крысят созревающие зернистые нейроны расположены диффузно, толщина ВЗС даже несколько больше, чем у 7-суточных крысят. В новой части мозжечка выявлено запаздывание уменьшения толщины НЗС, убыли экспрессии в нем DCX, с одной стороны, и отставание утолщения ВЗС и возрастания экспрессии NeuN в его нейронах по сравнению с таковыми в древней части мозжечка. Все это соответствует представлению об опережающем развитии в раннем онтогенезе коры древней части мозжечка. Таким образом, сравнительное иммуногистохимическое исследование динамики экспрессии пары молекулярных маркеров DCX и NeuN является эффективным способом оценки развития зернистых нейронов мозжечка в раннем постнатальном онтогенезе. Этот подход может быть использован также при изучении влияния на постнатальный морфогенез мозжечка различных экспериментальных воздействий и патологических состояний.

About the authors

S. M. Zimatkin

Grodno State Medical University

Email: smzimatkin@grsmu.by
Department of Histology, Cytology and Embryology

O. A. Karniushko

Grodno State Medical University

Email: karnyushko-olga@mail.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology

References

Supplementary files