CHARACTERISTICS OF THE RETINA IN CHRONIC STRESS IN LABORATORY RATS OF DIFFERENT AGE GROUPS

Full Text

Возрастные изменения в тканях глаза подчиняются общим законам старения организма и, вместе с тем, имеют свои особенности, обусловленные структурно-функциональной спецификой зрительного анализатора [3, 12, 16]. Важнейшими причинами патологического старения и возникновения связанных с возрастом заболеваний являются нарушения приспособительных реакций при воздействии различных стрессорных факторов [4]. При старении снижается стресс-устойчивость - способность человека или животного переносить значительные неблагоприятные воздействия без вредных последствий для организма, что может рассматриваться как фактор, способствующий развитию возрастных заболеваний [4-6, 22]. Отмечена неодинаковая стресс-устойчивость у животных и людей в различных возрастных группах [22]. Повреждающее действие светового стрессора приводит к деструктивным изменениям сетчатки глаза человека и животных, гемодинамическим расстройствам, нарушениям ультраструктуры эндотелиоцитов и базальной мембраны капилляров, апоптозу нейронов ганглионарного слоя [11, 20]. Работ с описанием морфологических изменений в сетчатке глаза при хроническом стрессорном воздействии в стареющем организме недостаточно для суждения об уровне стресс-устойчивости человека и животного к неблагоприятным воздействиям Цель данного исследования - изучение структуры сетчатки глаза у молодых и старых крыс, подвергшихся хроническому комбинированному стрессу. Материал и методы. Исследование проведено в соответствии с ГОСТом Р-534-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики» и правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (1986), одобрено региональным независимым этическим комитетом (ГУ Волгоградский медицинский научный центр): протокол № 140-2011 от 11.06.2011 г. Эксперименты проведены на аутбредных половозрелых крысах-самцах, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» РАМН и содержавшихся в стандартных условиях вивария с естественным 12-часовым светотемновым циклом при температуре воздуха 20±2 ºС, влажности 60% при свободном доступе к воде и полноценному гранулированному корму (ГОСТ Р 50258-92). Стрессирование животных вызывали путем комбинированного воздействия нескольких факторов в течение 7 сут по 30 мин ежедневно. Установка для стрессирования представляла собой камеру шириной 28×36×28 см3, разделенную на 6 изолированных отсеков (4×12×28 см3), закрепленную на наклонной плоской металлической платформе с углом наклона от 1 до 10º. Платформа оборудована электроприводом, совершающим качательные движения с частотой от 30 в 1 мин, имитирующие общую транспортно-технологическую вибрацию, передающуюся на тело живого объекта через опорные поверхности. Камера оснащена источником звукового шума (80 Дб) и тремя источниками света (20 Вт каждый), пульсирующими с периодом 2 с. Крыс помещали в изолированные отсеки и подвергали комбинированному или изолированному воздействию стрессоров: пульсирующий свет, громкий звук и покачивание. Ограничение подвижности, вызванное помещением крыс в тесные индивидуальные отсеки, служит дополнительным фактором, снижающим устойчивость к стрессу. Во время стрессирования температура внутри камеры повышалась на 7-8 ºС, что обусловлено теплоотдачей животных, источниками света и работающим мотором установки. Смена температурных условий при помещении животных в установку и извлечении из неё также снижает стресс-устойчивость. Действие стресса оценивали по развитию эрозивных и язвенных изменений в слизистой оболочке пищеварительного тракта, массе надпочечников и тимуса. Исследовали сетчатку глаз стрессированных крыс в возрасте 12 мес (молодые крысы, 1-я группа) и 24 мес (старые крысы, 2-я группа), а также двух контрольных групп того же возраста (интактные крысы - 3-яи 4-я группа), каждая группа включала по 10 особей. После энуклеации и осмотра глазá фиксировали в 10% забуференном растворе формалина, отмывали в проточной воде в течение нескольких часов, обезвоживали в этаноле восходящей концентрации и заливали в парафин. Ориентировку глаза в парафиновом блоке осуществляли по методике В. Н. Архангельского [2]. С помощью ротационного микротома готовили срезы толщиной 5 мкм, окрашивали гематоксилином - эозином, определяли толщину следующих слоев сетчатки: фоторецепторного (ФРС), наружного ядерного (НЯС), наружного сетчатого (НСС), внутреннего ядерного (ВЯС) и внутреннего сетчатого (ВСС). На 10 срезах, окрашенных по методу Ниссля, в 3-2 полях зрения при увеличении 400 у каждого животного определяли численную плотность клеток (ЧПК) в НЯС и ВЯС [8]. ЧПК в НЯС определяли как количество клеток на площади 1100 мкм2, в ВЯС - на площади 250 мкм2. Толщину слоёв сетчатки измеряли в трех полях зрения (по 6 измерений) при увеличении 400. Морфометрические показатели сетчатки оценивали с помощью камеры Tucsen is 1000 и программ (Image-Pro Plus, ImageJ и ISCapture). Анализ данных проводили с использованием статистической программы Statistica 6.0 и U-критерия Манна-Уитни. Различия считали значимыми при P≤0,05. Результаты исследования. Сетчатка глаза состоит из нейронов и глиальных клеток различных типов, образующих слои. Самый наружный слой сетчатки - пигментный эпителий у крысы представлен одним слоем низких столбчатых пигментоцитов с центрально расположенными, ориентированными вдоль сетчатки овальными ядрами. Пигментный эпителий лежит на базальной мембране (мембране Бруха), которая граничит с сосудисто-капиллярной пластинкой сосудистой оболочки глаза. Под слоем пигментного эпителия располагается слой палочек и колбочек, демонстрирующий двуслойность соответственно наружным и внутренним сегментам фоторецепторных нейронов. Ядерные и сетчатые слои сетчатки 12-месячных контрольных крыс четко выражены. Плотно расположенные ядра нервных и глиальных клеток в ядерных слоях округлой формы интенсивно окрашиваются гематоксилином. У 24-месячных контрольных крыс обнаружено нарушение слоистости сетчатки: НСС выявлялся на отдельных участках, тела нейронов и глиальных клеток располагались дисперсно, нарушая характерную для сетчатки глаза у млекопитающих слоистость; в НЯС (рис. 1) местами наблюдалось уменьшение плотности расположения клеток. ЧПК НЯС и ВЯС сетчатки у старых крыс контрольной группы относительно ЧПК соответствующих клеток у молодых крыс контрольной группы составила 69 и 83% соответственно. Анализ морфометрических данных сетчатки у старых животных показал, что инволюционные изменения затрагивают все ее слои (рис. 2). Сравнительный анализ морфометрических показателей сетчатки 12-месячных животных контрольной группы и стрессированных животных той же возрастной группы выявил уменьшение толщины ФРС на 18%, НЯС - на 31%, ВЯС - на 20%, НСС - на 50%, ВСС - на 25% (P≤0,01). ЧПК и толщина ВЯС у экспериментальных животных составила 75%, толщина НЯС - 85% (P≤0,01) от ЧПК и толщины тех же слоёв у контрольных животных (см. рис. 2). У 24-месячных стрессированных животных в ВЯС наблюдалось снижение ЧПК по сравнению с таковой в НЯС, толщина ФРС значимо (P≤0,01) уменьшилась на 34%, НЯС - на 64%, НСС - на 35%, ВСС - на 48%. Морфометрический анализ сетчатки стрессированных 12-месячных и контрольных 24-месячных крыс показал уменьшение разницы в показателях, характеризующих количество клеток: ЧПК в НЯС и ВЯС сетчатки глаза у старых крыс контрольной группы относительно таковой у стрессированных молодых крыс составила 81 и 90% (P≤0,01) соответственно. Уменьшение толщины ФРС, НСС и ВСС в этой же группе (24-месячных крыс) по отношению к показателям у 12-месячных стрессированных крыс составило 15, 16 и 35% (P≤0,01) соответственно. Обсуждение полученных данных. Настоящее исследование свидетельствует о структурной трансформации стареющей сетчатки, что согласуется с результатами других авторов, полученными при исследовании трупного материала [3, 15, 16]. Эти изменения они связывают с нейродегенеративными процессами, которые проявляются структурной деформацией, гибелью клеток сетчатки, наиболее выраженной в слое фоторецепторных нейронов и ганглиозных клеток [7, 12, 21], что объясняется увеличивающейся метаболической активностью клеток пигментного эпителия, приводящей к накоплению липофуцина и различных белков, в том числе β-амилоида, сопровождающимся апоптотической гибелью фоторецепторов, метаболически и структурно зависимых от клеток пигментного эпителия [5, 9, 11]. Структурные преобразования сетчатки, возможно, связаны с дегенеративными процессами, сопровождающими старение нервной ткани, находящейся в условиях постоянного фотодинамического напряжения и комбинированного стресса. В литературе широко обсуждаются причины, с возрастом приводящие к гибели нейронов сетчатки [1, 7]. Старение и возрастная патология ведут к снижению адаптации и остроты зрения, в патогенезе которых значительная роль отводится механизмам апоптоза [1, 10, 17]. Запуск программы, ведущей к смерти нейрона, как известно, может осуществляться цитокинами, гормонами, дериватами оксида азота, окисленными тиолами, продуктами модификации и последующей агрегации белков и нуклеиновых кислот [17-19]. Апоптотический механизм, несомненно, играет значительную роль в гибели фоторецепторов и ганглиозных клеток сетчатки, что подтверждается иммуногистохимически [1, 7, 15, 18, 19]. Используемый нами хронический комбинированный стресс со сменой разномодальных стрессоров (шум, вибрация, пульсирующий яркий свет) по стохастической схеме на фоне ограничения подвижности и повышающейся температуры окружающей среды вызывает у животных симптомы депрессивноподобного поведения, а также морфосоматические последстия: инволюцию тимуса и селезенки, гипертрофию надпочечников, изъязвления слизистой оболочки желудка [13]. Стрессорное мультифакторное воздействие, вероятно, усугубляет процессы, ведущие к развитию гибели клеток сетчатки. Более глубокие структурные изменения в сетчатке у старых крыс (24-месячных) по сравнению с таковыми у более молодых (12-месячных) можно объяснить снижением стресс-устойчивости и старением клеточных элементов сетчатки глаза. При сравнении морфометрических показателей сетчатки 12-месячных экспериментальных животных и 24-месячных контрольных животных обнаружено, что стрессассоциированная перестройка сетчатки у более молодых животных по морфометрическим показателям стремится к показателям у старых крыс контрольной группы и имеет менее выраженные различия по сравнению с различиями показателей у молодых - 12-месячных и старых - 24-месячных крыс контрольных групп, причем эта разница уменьшается по некоторым показателям в 3 раза и более, что, по-видимому, связано с ускорением нейродегенеративных процессов при стрессе [9, 11, 14, 19]. Таким образом, одним из основных проявлений, связанных со стрессом, является уменьшение ЧПК в ядерных слоях сетчатки. Проведенный морфометрический анализ сетчатки глаза старых и более молодых крыс показал, что морфологические изменения в ее слоях при комбинированном хроническом стрессорном воздействии и при старении имеют общий вектор, выражающийся в нейродегенеративных процессах. Показано, что микроструктура сетчатки глаза у стрессированных 12-месячных животных, согласно морфометрическим показателям, приближается к сетчатке старых - 24-месячных интактных крыс. Полученные данные позволяют сделать предположение о включении патогенетических механизмов ускоренного старения при длительном комбинированном стрессе.

About the authors

A. A. Nesterova

Volgograd State Medical University

Department of Histology, Embryology, Cytology

V. V. Yermilov

Volgograd State Medical University

Department of Forensic Medicine

I. N. Tiurenkov

Volgograd State Medical University

Department of Pharmacology and Biopharmaceutics, Postgraduate Medical Faculty

A. V. Smirnov

Volgograd State Medical University

Department of Pathological Anatomy

N. V. Grigoriyeva

Volgograd State Medical University

Department of Pathological Anatomy

V. L. Zagrebin

Volgograd State Medical University

Email: vlzagrebin@volgmed.ru
Department of Histology, Embryology, Cytology

L. N. Rogova

Volgograd State Medical University

Department of Pathological Physiology

O. N. Antoshkin

Volgograd State Medical University

Department of Histology, Embryology, Cytology

A. O. Dovgalyov

Volgograd State Medical University

Department of Histology, Embryology, Cytology

References

Supplementary files