DYNAMICS OF HISTOLOGICAL CHANGES IN THE FRONTAL CORTEX OF THE BRAIN OF RATS SUBJECTED TO PRENATAL ALCOHOL EXPOSURE

Full Text

Потребление алкоголя во время беременности приводит к развитию ряда специфических нарушений в организме плода, объединяемых в понятие фетальный алкогольный синдром, входящий в «спектр нарушений плода, вызванных алкоголем» [fetal alcohol spectrum disorders (FASD)] [2, 14]. Согласно литературным данным, кора большого мозга особенно чувствительна к пренатальному воздействию этанола [4, 5], который индуцирует у грызунов апоптоз нейронов и нейродегенеративные изменения [4]. Пренатальное воздействие алкоголя вызывает уменьшение числа и размеров пирамидных нейронов в коре мозга у животных, снижение в них содержания белка и недоразвитие цитоплазмы [7]. При этом в сенсомоторной коре у крысят наблюдаются признаки задержки развития нейронов и их дендритов, деструктивные и дистрофические изменения клеток (кариоцитолиз, хроматолиз, появление «клеток-теней»), значительные ультраструктурные нарушения [4, 14]. Вместе с тем, динамика гистологических изменений в постнатальном онтогенезе у этих животных изучена недостаточно. Цель настоящей работы - сравнительное изучение влияния пренатальной алкоголизации на гистологические характеристики нейронов фронтальной коры большого мозга у крыс различного Материал и методы. Опыты выполнены на 25 самках беспородных белых крыс с начальной массой 230±20 г и их потомстве (175 крысят). Все опыты проведены с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» [6]. На данное исследование получено разрешение комитета по биомедицинской этике (протокол № 7 от 23.12.2013 г.) Гродненского государственного медицинского университета. Животные находились на стандартном рационе вивария. Крысы подопытной группы на протяжении всей беременности (от дня обнаружения сперматозоидов во влагалищных мазках до родов) получали 15% раствор этанола в качестве единственного источника питья, а животные контрольной группы - то же количество воды. Среднее потребление алкоголя беременными самками составляло 4±2 г/(кг•сут). На 2-, 5-, 10-, 20-, 45-, 90-е сутки после рождения крысят взвешивали, декапитировали и определяли массу мозга и ее соотношение с массой тела. Кусочки переднего отдела коры полушарий большого мозга быстро фиксировали в жидкости Карнуа. Серийные парафиновые срезы окрашивали 0,1% толуидиновым синим по методу Ниссля и для выявления рибонуклеопротеинов (РНП) - по Эйнарсону. Гистологическое изучение, микрофотографирование, морфометрию и денситометрию осадка хромогена в гистологических препаратах проводили с помощью микроскопа Axioscop 2 plus (Zeiss, Германия), цифровой видеокамеры LeicaDFC 320 (Leica, Германия) и программы анализа изображения ImageWarp (Bitflow, США). Расположение фронтальной коры на гистологических препаратах мозга крыс определяли с помощью стереотаксического атласа [13]. На препаратах, окрашенных по методу Ниссля, измеряли толщину фронтальной коры мозга (по 5 измерений у каждого животного), в ее V слое определяли плотность расположения нейронов (в 5 полях зрения у каждого животного) и среди них подсчитывали количество клеток с различной степенью хроматофилии цитоплазмы (гипо-, гиперхромных, гиперхромных сморщенных и клеток-теней). Измеряли малый и большой диаметр тела нейрона и определяли площадь его сечения, фактор элоптации и фактор формы. У каждого животного оценивали не менее 30, а в каждой экспериментальной группе - 150 нейронов, что обеспечивало достаточный объем выборки для последующего анализа. Полученные средние цифровые данные по каждому животному анализировали методами непараметрической статистики с помощью программы Statistica 6.0 для Windows (StatSoft, Inc., США). В описательной статистике для каждого показателя определяли значения медианы (Ме), границы процентилей (от 25 до 75) и интерквартильного диапазона (IQR). Количественные результаты представлены в виде Me - медиана, LQ - верхняя граница нижнего квартиля; UQ - нижняя граница верхнего квартиля. Значимыми считали различия между показателями в контрольной и подопытной группах при P<0,05 (U-тест Манна-Уитни) [1]. Результаты исследования. Значимых различий массы тела, массы мозга и соотношения массы мозга и массы тела у контрольных и подопытных крысят не обнаружено. У контрольных крысят на протяжении всего срока наблюдения происходило утолщение фронтальной коры, тогда как у крысят, подвергавшихся антенатальной алкоголизации, по сравнению с контролем на 2-е сутки после рождения фронтальная кора была значимо толще на 33%, а на 5-е сутки - на 13%, на 10-е сутки толщина статистически значимо снижалась на 12%. На 20-еи 45-е сутки эти различия исчезали, но на 90-е сутки происходило повторное снижение толщины коры на 23% по сравнению с контролем (таблица). В V слое коры мозга у алкоголизированных крысят было обнаружено значимое снижение (на 10-25%) количества нейронов на единице площади среза (плотности расположения) во все изученные сроки (см. таблицу). У контрольных животных на препаратах, окрашенных по Нисслю, в различные сроки постнатального развития соотношение нейронов с различной степенью хроматофилии цитоплазмы существенно различалось; однако всегда преобладали нормохромные нейроны (рис. 1, а) (их доля составляла 60-70% от числа всех нейронов). У подопытных животных во все сроки в V слое коры мозга было выявлено уменьшение числа нормохромных нейронов и повышение количества гиперхромных сморщенных нейронов и клетоктеней, причем в различные сроки постнатального развития выраженность этих изменений была неодинаковой (см. рис. 1, б). Наименьшие изменения были выявлены на 2-е сутки, когда увеличение числа гипер-и гипохромных нейронов было статистически незначимо. Наибольшие изменения во фронтальной коре были выявлены на 20-90-е сутки постнатального развития. Так, на 45-е сутки количество гиперхромных сморщенных нейронов было увеличено на 66%, гипохромных - на 20%, клеток-теней - на 40% по сравнению с контролем (рис. 2). Гиперхромные сморщенные нейроны у контрольных животных на 45-еи 90-е сутки почти исчезали, а у подвергавшихся антенатальной алкоголизации их количество, напротив, резко возрастало (рис. 3). При исследовании размеров и формы тел нейронов выявлено статистически значимое временное увеличение площади сечения перикарионов нейронов V слоя у подопытной группы на 2-е сутки. Однако на 20-90-е сутки постнатального развития у подопытных крысят размеры тел нейронов становились значимо меньше, чем в контроле (см. рис. 3), в то время как у контрольных животных они прогрессивно увеличивались. У крыс, подвергшихся антенатальной алкоголизации, рост тел нейронов после 10-20-х суток постнатального развития останавливался (см. рис. 3). При этом была обнаружена отрицательная корреляция между площадью сечения тел нейронов и числом гиперхромных сморщенных нейронов (r=(-0,87)-(-0,98); P<0,05). Обнаружено, что содержание РНП в цитоплазме нейронов V слоя фронтальной коры у алкоголизированных крыс значимо выше на 5-еи 90-е сутки (см. таблицу) чем в контроле, что коррелировало с увеличением в эти сроки числа гиперхромных нейронов (r=0,86-0,96; P<0,05). Обсуждение полученных данных. Выявленное утолщение коры мозга у антенатально алкоголизированных крысят на 5-е и особенно 2-е сутки после рождения может быть связано с ее периваскулярным отеком и набуханием нейронов, что наблюдалось на гистологических препаратах. Именно на 2-е сутки была выявлена наибольшая корреляция между толщиной коры и площадью сечения тел нейронов (r=0,98; P<0,01). Последующее уменьшение толщины коры на 10-е сутки может быть связано с исчезновением отёка, а её повторное истончение на 90-е сутки - с тотальным сморщиванием нейронов, что подтверждается высокой корреляцией между толщиной коры и числом сморщенных нейронов (r=-0,94; P<0,01). В то же время, толщина коры у контрольных животных закономерно нарастала. Уменьшение размеров и сморщивание нейронов ранее было обнаружено и у взрослых крыс, подвергавшихся антенатальной алкоголизации [7, 9, 10]. В обеих исследованных группах в постнатальном онтогенезе наблюдалось уменьшение плотности расположения тел нейронов, что может быть связано с более интенсивным ростом нейропиля по сравнению с телами нейронов. Обнаруженное уменьшение плотности расположения нейронов во фронтальной коре у подопытных крыс во все изученные сроки после рождения, возможно, связано с гибелью части нейронов под действием алкоголя еще в период эмбриогенеза. Соответственно дефицит нейронов сохраняется у них пожизненно. Уменьшение толщины коры мозга и количества в ней нейронов, увеличение числа гиперхромных сморщенных нейронов и клеток-теней отмечалось в различные сроки после рождения у потомства крыс, потреблявших алкоголь во время беременности, и другими исследователями [12]. Выявленные у антенатально алкоголизированных крыс остановка роста и сморщивание нейронов с 20-х суток после рождения могут быть связаны с нарушением водно-солевого обмена и цитоскелета клеток, а также с окислительным стрессом, активацией процессов перекисного окисления липидов и окисления белков. При этом свободные радикалы, взаимодействуя с ДНК, структурно модифицируют ее. Кроме того, свободные радикалы повреждают клеточные мембраны, а также мембраны органелл клетки, в частности митохондрий нейронов, а уровень эндогенного антиоксиданта глутатиона снижается [9]. Алкоголь нарушает процессы транскрипции и трансляции в развивающемся мозгу, вызывает нарушение экспрессии генов [11]. При электронно-микроскопическом исследовании в гиперхромных нейронах выявляются уплотненная цитоплазма с щелевидными просветлениями и поврежденные органеллы, глубокие инвагинации ядерной оболочки, распад цистерн комплекса Гольджи на вакуоли, резкое набухание митохондрий [7]. Также, согласно данным литературы, этанол ингибирует экспрессию эндогенного инсулина, инсулиноподобного фактора роста (IGF) полипептидов, IGF-1 и IGF-2 рецепторов в мозгу. Результаты показывают, что основные нарушения в мозгу при FASD вызваны нарушениями в инсулин/IGF-сигнализации [10]. Выявленные структурные изменения могут лежать в основе известных неврологических и поведенческих нарушений у животных после антенатальной алкоголизации. Поведенческие нарушения включают когнитивные [3], сенсомоторные и эмоциональные расстройства [4]. К неврологическим дисфункциям, вызванным антенатальной алкоголизацией, относятся слуховая дисфункция, задержка речи, неспособность к обобщению и обучению [3]. В частности, пренатальная алкоголизация приводит к снижению двигательной активности 17-суточных крысят в тесте «открытое поле» и негативно отражается на их способности к выработке (но не воспроизведению) условного пищевого рефлекса. Кроме того, у животных развивается толерантность к алкоголю [8]. Таким образом, антенатальная алкоголизация вызывает глубокие и разнообразные гистологические изменения во фронтальной коре головного мозга крыс, которые в постнатальном онтогенезе имеют волнообразный, долговременный, а иногда и прогрессирующий характер. Так, выявлено увеличение (2-, 5-е сутки), а затем уменьшение толщины коры (на 10-еи 90-е сутки) и размеров нейронов (20-90-е сутки), снижение количества нейронов в V слое коры, уменьшение числа гиперхромных сморщенных нейронов и клетоктеней во все сроки исследования. Особенно интересны факт остановки роста и прогрессивное сморщивание нейронов фронтальной коры мозга с 20-х суток постнатального развития.

About the authors

S. M. Zimatkin

Grodno State Medical University

Email: zimatkin@grsmu.by
Department of Histology, Cytology and Embryology

Ye. I. Bon’

Grodno State Medical University

Department of Histology, Cytology and Embryology

References

Supplementary files