SOME REACTIONS OF THE REGIONAL LYMPH NODES OF RATS AFTER IMPLANTATION OF MULTIPOTENT STROMAL CELLS ADSORBED ON POLYHYDROXYALKANOATE INTO A BONE TISSUE DEFECT

Full Text

Несмотря на развитие травматологии и ортопедии, полное восстановление костных тканей является проблематичным, поскольку большие дефекты не могут спонтанно заживать. Использование стволовых клеток все больше расширяется с надеждой на успех терапевтических методов лечения ран и травм, на которые невозможно эффективно воздействовать современными хирургическими методами [5, 6, 8]. Красный костный мозг содержит прогениторные клетки (мультипотентные стромальные), способные к дифференцировке в костную, хрящевую и другие виды соединительной ткани. Это позволяет широко применять такие клетки для ускорения регенерации костей [1, 5, 10]. Имеются данные об эффективности использования клеточных технологий в стоматологии, бтравматологии и хирургии. Однако отсутствуют результаты исследования лимфатических узлов после указанных способов воздействия на репаративную регенерацию костной ткани, тогда как именно эти органы являются маркером выраженности воспалительного процесса в регионе, по их изменениям можно оценивать результативность проведения лечебных мероприятий, предсказывать развитие многих осложнений, а значит, и буспешно принимать меры по их профилактике. Цель настоящей работы - исследование изменений регионарных лимфатических узлов при имплантации аутологичных мультипотентных стромальных клеток костномозгового происхождения (АМСККП), адсорбированных на матриксе из полигидроксиалканоата (ПГА), для ускорения регенерации дефекта кости нижней челюсти. Материал и методы. Эксперименты проведены на 62 самцах крыс 6-месячного возраста инбредной линии Wag массой 180-200 г. Все манипуляции с животными осуществляли под общим ингаляционным эфирным наркозом в условиях чистой операционной с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12 августа 1977 г.; приказ Министерства высшего и среднего специального образования СССР № 742 от 13 ноября 1984 г.). АМСККП выделяли, вымывая костный мозг из эпифизов бедренных костей, полученную суспензию клеток помещали в пластиковые флаконы (Nunk, Дания), через 48 ч после эксплантации костного мозга неприкрепившиеся клетки сливали. Прикрепившиеся клетки культивировали в среде α-МЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Biolot, Россия) при 37 ºС в СО2-инкубаторе с 5% СО2 в условиях насыщенной влажности. Среду сменяли через каждые 3 сут. При субкультивировании монослойную культуру рассевали с плотностью 1000-5000 клеток/см2 (в зависимости от ростовых свойств используемой эмбриональной сыворотки), использовали стандартные растворы Версена и трипсина. Физические, морфологические, фенотипические признаки и дифференцировочный потенциал полученных клеток соответствовали таковым для АМСККП, которые были определены и описаны ранее [3]. АМСККП 2-го пассажа, полученные от крысы указанной линии, трансфицировали ДНК плазмиды pЕGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., США), содержащей ген зеленого флюоресцентного белка (GFP), под контролем промотора цитомегаловируса и ген устойчивости к неомицину под контролем промотора вируса SV40, необходимого для последующей селекции с использованием генетицина G418 (pEGFP-N1; Clontech Laboratories Inc., США). Подробный протокол трансфекции и способы оценки экспрессии введенного гена GFP в АМСККП изложены ранее [3]. ПГА (сополимер из 85% полигидроксибутирата и 15% гидроксивалериата) в виде матриксов холодного прессования (авторское название) диаметром и высотой 2 мм был предоставлен для исследования Институтом биофизики СО РАН (г. Красноярск). Полимер до адсорбции АМСККП стерилизовали в забуференном физиологическом растворе для культур клеток в автоклаве при 120 ºС, давлении в 1 атм в течение 20 мин. Непосредственно перед введением приготовленный для имплантации фрагмент матрикса из ПГА для пассивной адсорбции клеток погружали в суспензию АМСККП в культуральной среде (1×106 клеток в 1 мл суспензии) на 2 ч в связи с тем, что живые клетки прикрепляются к любому твердому субстрату. Под общим ингаляционным эфирным наркозом в условиях чистой операционной при соблюдении правил асептики и антисептики после обработки кожи спиртом скальпелем делали разрез кожи длиной 1,5-2 см по нижнему краю нижней челюсти. Тупым способом при помощи распатора отслаивали жевательную мышцу и обнажали поверхность кости нижней челюсти в области ее угла. Стоматологическим бором делали круглое отверстие диаметром 2 мм в кости угла нижней челюсти, с полостью рта дефект кости не сообщался. После внедрения имплантата из ПГА и адсорбированными АМСККП или без клеток (контроль) послойно ушивали рану викрилом. Животных с признаками гнойно-воспалительных осложнений (абсцессы в подкожной основе) из эксперимента исключали. Спустя 1, 2, 3, 4 и 5 нед после операции поднижнечелюстные (регионарные к месту применения АМСККП) лимфатические узлы фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 ч, обезвоживали в серии этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в парафин. Неокрашенные срезы толщиной 5-7 мкм изучали под световым микроскопом Axioimager M1 (Carl Zeiss, Германия) при увеличении до 1200 раз в режиме люминесценции с фильтром Alexa 488. На каждую временную точку исследования было использовано от 6 до 12 особей. Результаты исследования. Через 1 нед после имплантации матрикса из ПГА и адсорбированными на нем АМСККП в (регионарных) поднижнечелюстных лимфатических узлах при исследовании в люминесцентном режиме микроскопа были обнаружены овальные скопления ярко светящихся очень крупных клеток, располагавшихся в лимфоидных узелках. Во флюоресцирующих клетках светилась не вся цитоплазма, а разные по размерам овальные гранулы, т. е. клетка представляла собой скопление ярко светящихся частиц с четкими ровными краями. Иногда было видно темное овальное ядро (рисунок, а, б). Спустя 2 нед после применения имплантата из ПГА и АМСККП, в лимфатических узлах количество крупных светящихся клеток увеличилось. При этом возросло как количество их овальных скоплений, так и число клеток в них. По-прежнему в таких клетках светилась не вся цитоплазма, а множество различных по размерам гранул (см. рисунок, в, г). К 3-й неделе площадь скоплений крупных светящихся клеток значительно уменьшилась, сократилось также и количество клеточных элементов в них. Вместе с этим в структурах лимфатических узлов резко возросло число флюоресцирующих клеток, расположенных поодиночке (см. рисунок, д). Этот процесс сокращения размеров скоплений светящихся клеток и числа последних прогрессировал, ик 4, и 5 нед после операции можно было видеть не равномерное расположение этих крупных светящихся клеток в лимфоидных узелках, а их нахождение по периферии узелков. Также происходило постепенное уменьшение количества светящихся гранул в указанных крупных клетках (см. рисунок, е). Места овальных скоплений светящихся клеток имеют четкую границу и отличаются по плотности и фоновой окраске от окружающих тканей (см. рисунок, б, г, е). В некоторых случаях хорошо видна аутофлюоресценция эритроцитов в сосудах, проходящих рядом со скоплениями крупных светящихся клеток и внутри них (см. рисунок, г, е). В лимфатических узлах у животных после введения имплантата из ПГА без АМСККП светящиеся клетки отсутствовали как расположенные поодиночке, так и в виде скоплений, как в лимфоидных узелках, так и в других структурах лимфатического узла. В широком поле зрения были видны единичные небольшие светящиеся объекты, но это были эритроциты во внутриузловых сосудах (см. рисунок, ж, з). Обсуждение полученных данных. Процессы репарации искусственно созданного дефекта костной ткани в области угла нижней челюсти у крыс как без какого-либо воздействия, так и при использовании имплантата из ПГА без АМСККП, подробно описаны нами ранее [2, 3]. В поднижнечелюстных лимфатических узлах после имплантации матрикса из ПГА с адсорбированными АМСККП с трансфицированным геном GFP в дефект кости нижней челюсти были обнаружены скопления ярко светящихся крупных клеток, которые располагались, по-видимому, в лимфоидных узелках, в пользу чего свидетельствует то, что такие скопления имеют шаровидную форму и расположены только в корковом веществе недалеко от капсулы. Скорее всего, светящиеся клетки в лимфатических узлах являются макрофагами. Такое заключение можно сделать, основываясь на их размерах, сходных с таковыми у макрофагов, неправильной форме, наличии множества разной величины включений, которые могут являться лизосомами с поглощенным флюоресцентным материалом, а также расположении в герминативных центрах лимфоидных узелков, где макрофагов очень много и имеются данные об их аутофлюоресценции в некоторых условиях [7, 13]. Однако в таком случае должна быть точно такая же флюоресценция макрофагов в лимфатических узлах у животных после введения имплантата из ПГА без АМСККП, но в данном случае в лимфатических узлах светятся только небольшие клетки (эритроциты, обладающие аутофлюоресценцией [4, 15]), а скопления крупных светящихся клеток независимо от формы полностью отсутствуют. Можно предположить, что крупные светящиеся клетки в лимфатических узлах являются не просто макрофагами, а макрофагами, которые фагоцитировали введенные АМСККП или структуры, сформированные из таких клеток. Имеются данные, указывающие на возможность флюоресценции макрофагов за счет свечения фагоцитированного и метаболизированного материала в их гранулах [9, 11, 12]. В месте повреждения кости нижней челюсти с последующей имплантацией матрикса из ПГА с адсорбированными на нем АМСККП развивается асептическая воспалительная реакция, характеризующаяся поступлением в регионарные лимфатические узлы большого объема тканевого детрита. Несомненно, что вместе с этим детритом в лимфатические узлы поступают и часть введенных АМСККП, которые не все жизнеспособны. В лимфатических узлах макрофаги поглощают антигенный материал и, видимо, попавшие туда АМСККП вместе со светящимся белком GFP и их фрагменты. В таких случаях лизосомы макрофагов, в которых находится флюоресцентный белок, могут светиться при воздействии ультрафиолетового света так же, как и сами АМСККП с трансфицированным геном GFP. Не исключено и встраивание ДНК белка GFP в геном макрофагов, и накопление этого белка, но такая возможность маловероятна. То, что макрофаги с поглощенным клеточным светящимся детритом сконцентрированы в лимфатических узлах в герминативных центрах лимфоидных узелков, можно объяснить с двух позиций. Во-первых, в герминативных центрах идут размножение, активация и дифференцировка клеток В-линии, которые в дальнейшем будут синтезировать антитела к определенным антигенам. Для запуска и успешного осуществления этого процесса необходимо присутствие макрофагов с данным антигеном. В герминативных центрах имеются множество макрофагов, которые могут поглощать антигены из окружающих тканей и, видимо, лимфы, проходящей по межузелковым синусам. Во-вторых, макрофаги могут фагоцитировать светящиеся клетки или вышедший из них при разрушении белок GFP из лимфы и затем или мигрировать в лимфоидные узелки для активации и запуска процесса пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов, или передавать антигены другим макрофагам, находящимся уже непосредственно в узелках. Существует возможность фагоцитирования АМСККП и продукта их распада в месте имплантации матрикса из ПГА, миграции макрофагов с антигеном в лимфатические узлы вместе с током лимфы и уже в них передачи антигенов фагоцитам герминативных центров. Таким образом не исключено создание иммунной защиты против введенных АМСККП с трансфицированным геном GFP или самого светящегося белка. Не исключено, что после повторного введения клеток с трансфицированным геном GFP такие клеточные элементы будут очень быстро уничтожаться системой иммунитета, и из них никаких структур не будет формироваться. Необходимо рассмотреть еще одну возможную причину свечения макрофагов. Известно, что эритроциты обладают аутофлюоресценцией [4, 15]. При моделировании повреждения кости нижней челюсти повреждаются многочисленные кровеносные сосуды, и эритроциты оказываются в тканях. В месте геморрагий клетки крови поглощаются макрофагами (сидерофагами), кроме того, эритроциты из тканей поступают в регионарные лимфатические узлы, где также фагоцитируются макрофагами. Такое присутствие эритроцитов и продуктов их распада в лизосомах макрофагов может обусловить их флюоресценцию под воздействием ультрафиолетового облучения. Есть данные о флюоресценции макрофагов вследствие наличия в них гемосидерина [13, 14]. Однако при исследовании лимфатических узлов у животных в условиях использования имплантата из ПГА без АМСККП скопления светящихся макрофагов обнаружены не были. В проведенном нами исследовании к окончанию времени наблюдения было отмечено постепенное уменьшение количества светящихся гранул в таких макрофагах. Введенные АМСККП постепенно замещаются собственными клетками и структурами. Вследствие того, что структур, построенных из имплантированных АМСККП, становится все меньше, в лимфатических узлах сокращаются количество светящихся макрофагов, содержание светящихся гранул в них и интенсивность свечения. Итак, после внедрения в участок повреждения кости нижней челюсти имплантата из ПГА и адсорбированными АМСККП с трансфицированным геном GFP в лимфоидных узелках регионарных лимфатических узлов появляются многочисленные крупные макрофаги с множеством овальных светящихся включений в цитоплазме. Численность таких макрофагов нарастает в течение 2 нед после операции, а далее начинает уменьшаться. Видимо, введенные таким способом АМСККП частично поглощаются макрофагами. При разрушении структур, сформированных из АМСККП, детрит также фагоцитируется макрофагами. В том и другом случае эти макрофаги оказываются в герминативных центрах лимфоидных узелков лимфатических узлов, где не исключена инициация иммунитета против ДНК и белка GFP.

About the authors

I. V. Maiborodin

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine

Email: imai@mail.ru
The Center of New Medical Technologies

V. A Matveyeva

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine

The Center of New Medical Technologies

R. V. Maslov

A. I. Yevdokimov Moscow State Medico-Stomatologic University

Department of Periodontology, Stomatologic Faculty

N. V. Onopriyenko

Novosibirsk State Medical University

Department of Obstetrics and Gynecology

I. V. Kuznetsova

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine

The Center of New Medical Technologies

G. A. Chastikin

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine

The Center of New Medical Technologies

A. A Anikeyev

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine

The Center of New Medical Technologies

References

Supplementary files