MORPHOMETRIC AND HISTOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF THE THYROID GLAND AFTER ADMINISTRATION OF HYDRA PEPTIDE MORPHOGEN

全文:

Биологически активный ундекапептид природного происхождения - пептидный морфоген гидры (ПМГ) - является одним из интенсивно изучаемых эндогенных регуляторных олигопептидов, влияющих на жизненно важные процессы в организме человека и животных [1, 9-11, 23, 26]. ПМГ первоначально был выделен из организма пресноводного кишечнополостного животного - гидры (Hydra attenuata) [27-29], в дальнейшем он был обнаружен в тканях представителей беспозвоночных, позвоночных животных [2, 7, 24, 29] и человека [5, 18]. Синтез ПМГ и ряда его структурных аналогов и фрагментов был проведен в 1992 г. [16]. Методами биологического тестирования и биохимического анализа установлено влияние ПМГ на процессы роста, активность нервной, репродуктивной и эндокринной систем [5, 7, 29]. Целью проведенных экспериментальных морфологических исследований действия ПМГ на ткани явилось преимущественно изучение его влияния на пролиферацию клеток. Показано стимулирующее воздействие ПМГ на процессы синтеза ДНК и деление клеток в различных тканях млекопитающих: эпителиях языка, трахеи, роговицы и мышечных тканях [9, 11, 20]. Между тем, воздействие ПМГ на структурные и метаболические изменения тканей остается мало изученным. В частности, отсутствуют данные о влиянии ПМГ на морфофункциональные свойства тиреоидного эпителия и щитовидную железу в целом. В этой связи целью данного исследования явилось изучение морфофункциональных изменений щитовидной железы при введении ПМГ. Материал и методы. Опыты проведены на 40 нелинейных взрослых белых мышах-самцах массой 20-25 г. Животным экспериментальной группы (n=28) вводили ПМГ внутрибрюшинно 5-кратно с интервалом 24 ч из расчета 100 мкг/кг массы тела. Выбор дозы ПМГ обоснован ранее проведенными исследованиями, указавшими на ее митогенный эффект [20]. Животным основной контрольной группы (n=7) с той же кратностью инъецировали эквиобъемное количество растворителя - стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Для сравнения была 2-я контрольная группа, которую составили 5 интактных мышей. Животных декапитировали под легким эфирным наркозом через 24 ч после заключительной инъекции ПМГ. Содержание животных, проведение и выведение их из эксперимента осуществляли с соблюдением правил, утвержденных этическим комитетом СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова [17]. Щитовидную железу фиксировали в течение 24 ч в жидкости Карнуа, обычным способом обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации и заливали в парафин. На поперечных срезах, окрашенных гематоксилином - эозином, проводили морфометрические исследования, включающие стереологическую оценку относительных объемов, занимаемых в щитовидной железе эпителием (Е), включая фолликулярный (Еf) и интерфолликулярный (Еi) компоненты, коллоидом (С) и стромой (S). Измерения выполняли с помощью стереологического метода точечного счета, используя тест-сетку окулярного микрометра с 25 точками; в ходе исследования учитывали данные, полученные при регистрации 1000 точек. Измерения проводили в обеих долях железы в области промежуточной зоны, исключая наиболее периферические отделы, максимально подвергающиеся сжатию при фиксации. На основании полученных данных, определяли соотношение Е/С, которое служило показателем активности щитовидной железы, а также соотношение Еf/Еi, которое использовали как показатель степени ее фолликулярной организации [3, 4]. Подсчитывали митотически делящиеся тироциты в фолликулярном эпителии, просматривая у каждой мыши, в среднем, не менее 3000 клеток на 5 срезах. Долю делящихся клеток в популяции тироцитов - митотический индекс (МИ) выражали в промилле. На криостатных срезах замороженного нефиксированного материала толщиной 10 мкм проводили гистоэнзимологическое исследование: при использовании тетразолиевого метода осуществляли выявление ферментов -регуляторов энергетического обмена: NADH-диафоразы (NADH-д), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ) [12, 13]. Количественную оценку активности ферментов осуществляли в цитоплазме тироцитов на спектроцитофотометре (оригинальной конструкции, собранной на основе насадки ФМЭЛ (ЛОМО, СССР) плаг-методом при об. 40, ок. 7, площади зонда 0,785 мкм2 и длине волны 545 нм [6]. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием программного пакета Statistica for Windows v 6.0. Значимость различий средних величин показателей оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при Р<0,05. Результаты исследования. Щитовидная железа животных обеих контрольных групп имеет типичное фолликулярное строение, причем более крупные фолликулы вариабельной формы располагаются в периферической и промежуточной зонах долей, тогда как мелкие округлые фолликулы сосредоточены, преимущественно, в центральной зоне (зональная гетероморфия). Высота тироцитов варьирует как между отдельными фолликулами (интерфолликулярная гетероморфия), так и в пределах одного фолликула (интрафолликулярная гетероморфия). По данным стереологического анализа, у животных контрольной группы средние относительные объемы (волюметрические фракции), занимаемые в железе фолликулярным и интерфолликулярным эпителием, а также коллоидом, составляют 25,9±1,1, 13,5±1,0 и 32,0±1,1% соответственно. У животных, получавших ПМГ, общий план строения органа не менялся, в частности визуально не были обнаружены отличия характера фолликулярной организации, формы и размеров фолликулов, их распределения по зонам доли. Сохранялась также гетероморфия органа. По данным морфометрического анализа, введение ПМГ вызывало статистически значимое почти 2-кратное увеличение относительного объема тиреоидного эпителия и его компонентов (Еf иЕi) по сравнению с контрольным уровнем. Воздействие ПМГ приводило также к статистически значимому снижению относительного объема коллоида - в 1,4 раза (рис. 1). Соотношение Ef/Ei значимо не отличалось от такового в контроле, поскольку изменения этих компонентов имели однонаправленный и пропорциональный характер. Между тем, соотношение Е/С увеличивалось с 1,2 в контроле до 2,9 в подопытной группе (в 2,7 раза; Р<0,05) (рис. 2). После воздействия ПМГ наблюдалось нарастание митотической активности в 1,2 раза по сравнению с контролем (рис. 3). При проведении гистохимических реакций выявления NADH-д, СДГ, ЛДГ у животных контрольной и экспериментальной групп окрашенные продукты реакций (диформазаны) в виде мелкозернистого пылевидной железы в контрольной группе мышей (светлые столбики) и после воздействия пептидного морфогена гидры (темные столбики). Ядра клеток не содержали продукта реакции. Характер распределения продуктов реакций в тироцитах не менялся под влиянием ПМГ, однако уже визуально отмечалось некоторое нарастание активности изученных ферментов. При количественной цитофотометрической оценке выявлено статистически значимое увеличение интенсивности гистохимических реакций: средняя активность NADH-д в тироцитах увеличивалась в 1,7 раза, СДГ - в 1,3 раза, ЛДГ - в 1,5 раза по сравнению со значениями в контроле (рис. 4). Обсуждение полученных данных. Щитовидная железа у мышей контрольной группы имеет типичное фолликулярное строение и характеризуется свойственной этому органу гетероморфией, которая проявляется на зональном, интерфолликулярном и интрафолликулярном уровнях. Морфометрические показатели, характеризующие относительные объемы (волюметрические фракции), занимаемые в железе ее структурными компонентами (E, Ef, Ei, C), а также соотношения E/Си Ef/Ei находятся в пределах величин, ранее описанных в литературе [3, 4, 21]. Введение ПМГ в течение 5 сут, в целом, не вызывает значительных изменений строения щитовидной железы у мышей, в частности, характера ее фолликулярной организации и зональности долей, а также выраженности гетероморфии. Между тем, при воздействии ПМГ морфометрический анализ показал 2-кратное увеличение относительного объема (волюметрической фракции) тиреоидного эпителия при одновременном снижении относительного объема коллоида в 1,4 раза. Выявленные изменения указывают на усиление процессов резорбции тиреоидного коллоида, т. е. на повышение функциональной активности щитовидной железы в целом, поскольку активация резорбции коррелирует с повышенной секрецией тиреоидных гормонов [4, 19, 21]. Соотношение волюметрических фракций тиреоидного эпителия и коллоида, которое считается показателем активности щитовидной железы [3, 4], после введения ПМГ увеличивается в 2,7 раза. Между тем, соотношение волюметрических фракций эпителия (Еf и Ei), которое служит показателем степени организации эпителия в фолликулы, после введения ПМГ значимо не отличалось от такового в контроле, что свидетельствует об отсутствии влияния ПМГ (по крайней мере, при исследованном режиме введения и дозировке) на общий план строения, т. е. архитектонику железы. В проведенном исследовании выявлена статистически значимая митогенная реакция (увеличение МИ в 1,6 раза), которая сочеталась с активацией тиреоидного эпителия под влиянием ПМГ. Результаты определения уровня митотической активности в эпителии щитовидной железы лежат в пределах величин, приведенных в работах других авторов [15, 25]. Данные об активности ферментов и их локализации в щитовидной железе, полученные в настоящем исследовании, согласуются с описаниями соответствующих гистоэнзимологических реакций в этом органе [3, 8]. Выявленный в ходе морфометрического исследования эффект повышения активности щитовидной железы согласуется с результатами проведенного цитофотометрического анализа: введение ПМГ стимулирует метаболические процессы в тиреоидном эпителии, на что указывает нарастание активности ферментов: максимально выраженное для NADH-д, умеренно - для ЛДГ и минимально - для СДГ. Как показывают данные, полученные на различных экспериментальных моделях, изменения метаболизма тироцитов отражают (возможно и определяют) сдвиги их функциональной активности [3, 8, 21, 22]. Таким образом, морфометрические и гистохимические данные свидетельствуют об активации тиреоидного эпителия и щитовидной железы в целом при воздействии ПМГ. Эти выводы согласуются со сведениями об усиленной секреции тиреоидных гормонов у животных, получавших ПМГ [14]. Морфофункциональных исследований влияния ПМГ на тиреоидный эпителий или щитовидную железу, как орган, ранее не проводили. Механизм воздействия ПМГ на тироциты остается неизученным. Описанное действие ПМГ может объясняться как его прямым влиянием на эти клетки, так и эффектом, опосредованным гипофизом [14]. В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что ПМГ оказывает влияние на щитовидную железу, активируя процессы клеточного деления, дифференцировку ее эпителия и метаболические сдвиги. Поскольку ПМГ относится к классу регуляторных нейропептидов [1, 23], можно предположить, что, подобно другим представителям этого класса, он является одним из элементов сложной нейропептидной регуляторной системы, которая контролирует различные функции клеток щитовидной железы - пролиферацию, дифференцировку, функциональную активность, опухолевый рост. Результаты проведенных нами исследований, свидетельствующие о стимулирующем влиянии ПМГ на функциональное состояние и пролиферативную активность тироцитов, могут представлять интерес в связи с поиском факторов, регулирующих рост щитовидной железы. Выявление таких факторов особенно важно вследствие чрезвычайной распространенности заболеваний, связанных с нарушением пролиферации тироцитов, которое лежит в основе развития зоба, доброкачественных и злокачественных новообразований этого органа. Авторы искренне благодарят заведующую лабораторией синтеза пептидов Института экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научнопроизводственного комплекса МЗ и СР РФ (Москва) Ж. Д. Беспалову за ПМГ, любезно предоставленный для проведения экспериментов.

作者简介

V. Kulayeva

First St. Petersburg I. P.Pavlov State Medical University

Email: Weta65@list.ru
Department of Histology, Embryology and Cytology

V. Bykov

First St. Petersburg I. P.Pavlov State Medical University

Email: vbykov@spmu.rssi.ru
Department of Histology, Embryology and Cytology

参考

补充文件