MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS OF OSSEOINTEGRATION AFTERAPPLICATION OF TITANIUM IMPLANTS WITH BIOACTIVE COATING AND RECOMBINANT BONE MORPHOGENETIC PROTEIN

Full Text

Одним из бурно развивающихся направлений ,регенеративной медицины является восстановительная хирургия костей и суставов, основанная на использовании биосовместимых неудаляемых конструкций. Достижение адекватных топографоанатомических и функциональных характеристик скелета при таком подходе немыслимо без полноценной управляемой остеоинтеграции имплантатов [3, 8]. Основным подходом к улучшению остеоинтеграции имплантатов в настоящее время является активная модификация поверхности контакта с окружающей костью. Высокая удельная площадь контакта обеспечивается при этом за счет создания биоактивной трехмерно-пористой поверхности, которая стимулирует как новообразование, так и ремоделирование кости, т. е. обладает остео индуктивным и остеокондуктивным свойствами. В качестве дополнительного биоактивного покрытия могут выступать частицы того же сплава, оксиды титана, тантала, гидроксиапатит или иные вещества, миметичные минеральному матриксу кости [4, 12, 16]. Хотя возможности этого подхода еще далеко не исчерпаны, в настоящее время предпринимаются качественно иные попытки усилить остеоинтеграцию, которые основаны на внесении в зону имплантации тканеспецифичных факторов роста. Влияние на остеогенез и резорбцию кости (которая также абсолютно необходима для полноценной адаптации биосовместимого имплантата) доказано для многих тканевых факторов роста (эпидермального, тромбоцитарного, трансформирующего фактора роста TGF-β и др.), костных морфогенетических белков (BMP), матриксных металлопротеиназ (MMP) и их тканевых ингибиторов (TIMP), а также большинства известных цитокинов. Для нужд регенеративной медицины наиболее перспективным оказался BMP-2, обеспечивающий дополнительную стимуляцию остеоинтеграции [2, 10, 12, 13]. Сравнительно недавно в России был разработан оригинальный способ получения рекомбинантного человеческого BMP-2 (rhBMP-2) с помощью высокоэффективного штамма-продуцента на основе Escherichia coli, активность которого показана в экспериментах in vitro и in vivo [6, 9]. На основе rhBMP-2 создан остеопластический материал «Gamalant™-паста-ФОРТЕ Плюс», обладающий высокой остеоиндуктивностью и влияющий на процессы репаративного остеогенеза [6, 7]. Имеется первый опыт хирургического применения материала [1], продемонстрировавший его эффективность для лечения травм длинных костей и позвоночника. Изучение морфологических особенностей области имплантации при использовании rhBMP-2 в качестве фактора роста для улучшения остеоинтеграции имплантатов с биоактивными поверхностями представляется актуальным как с точки зрения оценки на морфологическом уровне эффективности применяемых в травматологии костно-пластических материалов, содержащих rhBMP-2, так и для понимания клеточных и молекулярных механизмов стимуляции остеоинтеграции, индуцируемой этим фактором роста. Цель настоящей работы - изучить в эксперименте морфологические особенности остеоинтеграции титановых имплантатов с трехмернокапиллярно-пористым биоактивным покрытием (ТКПБП) на фоне внесения в зону имплантации материала, содержащего rhBMP-2. Материал и методы. Исследование проведено на 22 белых крысах-самцах линии Вистар 8-месячного возраста массой 240-290 г. Протокол экспериментов соответствовал этическим нормам, изложенным в «Правилах проведения работ с использованием экспериментальных животных» и Директиве 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях. Использовали титановые имплантаты с ТКПБП и дополнительным биокерамическим слоем толщиной от 10 до 40 мкм, созданным с помощью микродугового оксидирования в Институте металлургии и материаловедения им. А. А. Байкова РАН. Адгезивные свойства и наличие пор размером 150-250 мкм обеспечивают данным имплантатам высокую способность к остеоинтеграции, которая ранее была показана в опытах на собаках [4]. Под наркозом (золетил в дозе 40 мг/кг массы внутрибрюшинно) по наружной поверхности нижней трети бедра у крыс осуществляли чрезмышечный доступ к дистальному эпифизу бедренной кости. С помощью низкооборотного сверла формировали канал диаметром 1,5 мм и глубиной 5 мм с отклонением оси канала от вертикали на 30 º. У 9 животных 1-й группы имплантаты с ТКПБП помещали в костные каналы после внесения в них 2 мкл материала «Gamalant™-паста-ФОРТЕ Плюс» (Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи, Россия). Препарат содержит гидроксиапатит синтетический наноструктурный, коллаген животного происхождения, желатин и фактор роста костной ткани rhBMP-2, модифицированный, обеспечивающий повышенное содержание активной димерной формы фактора в препарате [6]. Такому же количеству животных 2-й группы в аналогичные костные каналы устанавливали имплантаты с ТКПБП, но без внесения материала, содержащего rhBMP-2. Из каждой подопытной группы по 3 животных выводили передозировкой золетила (200 мг/кг массы) через 4, 8 и 12 нед после установки имплантатов. В качестве контроля исследовали 6 образцов интактных бедренных костей 4 крыс, находящихся все время эксперимента в условиях того же вивария. Для исследования использовали сертифицированное гистологическое оборудование - аппарат для проводки Microm STP 420 (Microm, Германия), модульную систему заливки Leica EG 1160 (Leica, Германия), ротационный микротом Leica RM 2255 (Leica, Германия), коверстейнер Dako (Dako, Дания), иммуногистостейнер Dako Link 48 (Dako, Дания), микроскоп Leica DM 6000B с цифровой камерой Leica DFC50С (Leica, Германия). Имидж-анализ проводили с помощью программы «ImageJ» (США). Гистологические препараты приготавливали после фиксации материала в 10% растворе нейтрального забуференного формалина и декальцинации в растворе «Cal-Ex®» (Fisher Scientific, Германия), срезы окрашивали гематоксилином - эозином, трихромным методом по Массону [5]. Определяли среднюю толщину кортикального слоя кости, костных трабекул и зоны остеоинтеграции (мкм), объемную долю костной ткани в зоне остеоинтеграции и прилегающей губчатой кости (%) [14]. Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием моноклональных антител к маркеру клеток остеогенного ряда остеонектину (NCL O-nectin, 15G12, Novocastra, Великобритания), маркеру макрофагов и остеокластов CD68 (наборы Novocastra, Великобритания), MMP-9 (клон MMP9-439, Leica Mycrosystems, Германия) и TIMP-1 (клон VT7, Dako Cytomation, Дания). Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода с высокотемпературной демаскировкой антигенов, использовали позитивные контроли антигенов, негативные контроли антигенов и антител. Определяли численную плотность иммунопозитивных клеток в ткани, непосредственно окружающей имплантат. Результаты выражали в 103/мкм3. Все морфометрические исследования проводили на двух препаратах от одного образца кости в 5 полях зрения, так что в статистический массив по каждой выборке было включено от 40 до 48 измерений. Обработку количественных данных осуществляли с помощью программы Statistica 12 (StatSoft Inc., США) с учетом общепринятых требований для медико-биологических исследований. Поскольку с помощью критериев Колмогорова- Смирнова и Шапиро-Уилка была подтверждена ненормальность распределения полученных параметров, для статистической обработки были использованы непараметрические критерии. Распределение в группах выражали в виде медианы и интервала между 1-ми 3-м квартилем. При сравнении результатов в разные сроки эксперимента с контролем проведен дисперсионный анализ с использованием непараметрического критерия Фридмана для множественных групп (P<0,01), при этом контрольные данные принимали за нулевую точку. Для анализа различий между подопытными группами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (P<0,01). Результаты исследования. Через 4 нед от начала эксперимента при гистологическом исследовании вокруг имплантатов с внесением в костный канал материала, содержащего rhBMP-2, был обнаружен фиброзный регенерат с многочисленными остео-и хондрогенными участками. Граница ткани после удаления имплантата была неправильной формы с частичным отрывом тканей, что свидетельствовало о хорошей интеграции имплантата. Ремоделирование окружающей кости происходило крайне интенсивно (рис. 1, а). В костной ткани вокруг имплантатов у животных 2-й группы обнаруживался тонкий слой рыхлой соединительной ткани, богатой сосудами с очагами остеогенеза. В прилежащей губчатой кости выявлялись небольшие участки остеокластической резорбции и слой остеобластов по краям костных балок, что свидетельствовало об активной перестройке костной ткани. К 8-недельному сроку основной объем зоны остеоинтеграции вокруг имплантатов с ТКПБП у животных 1-й группы был заполнен молодой грубоволокнистой костной тканью. Прилежащая губчатая кость находилась в состоянии интенсивного ремоделирования с явным увеличением объема костных балок (см. рис. 1, б). У животных 2-й группы ткань вокруг имплантата представляла собой смешанный регенерат, в котором преобладала грубоволокнистая костная ткань с концентрическим направлением коллагеновых волокон вокруг имплантата. Глубокие слои регенерата без четких границ переходили в прилежащую губчатую кость с признаками активного ремоделирования. Форма и характер границы прилежащей кости с полостью после удаления имплантата свидетельствовали о высокой степени остеоинтеграции. К 12-й неделе вокруг титановых имплантатов с ТКПБП в группе с использованием материала, содержащего rhBMP-2, была обнаружена тонкая фиброзная зона, окруженная компактным костным веществом. Граница отделения от имплантата имела признаки высокой степени остеоинтеграции. Прилежащая губчатая костная ткань была представлена плотно расположенными костными балками с признаками остеогенного ремоделирования. У животных 2-й группы процесс остеоинтеграции завершался, признаки репаративного ремоделирования прилежащей губчатой кости практически отсутствовали. В обеих подопытных группах имплантация сопровождалась значимым увеличением толщины кортикальной пластинки прилегающих участков бедренной кости. Эффект от введения материала отчетливо прослеживался до 8 нед после имплантации (рис. 2). В случае использования rhBMP-2 в составе имплантатов с 4-недельного срока наблюдалось увеличение толщины кортикального слоя кости (см. рис. 2, а), костных трабекул (см. рис. 2, б), а также объемной доли костной ткани как в зоне остеоинтеграции (см. рис. 2, г), так и в прилежащей губчатой кости (см. рис. 2, д). Значимое увеличение толщины зоны остеоинтеграции (см. рис. 2, в) у животных 1-й группы по сравнению с таковой у крыс 2-й группы наблюдалось с 8-й недели. Введение материала, содержащего rhBMP-2, начиная с ранних сроков эксперимента, обеспечивало появление более многочисленной популяции остеогенных клеток вокруг имплантата при несколько меньшем количестве клеток, способных к остеорезорбции (рис. 3, а, б). В зоне остеоинтеграции у животных 1-й группы обнаруживались многочисленные, относительно равномерно распределенные клетки с высокой экспрессией MMP-9 (см. рис. 3, в). Количество клеток, экспрессирующих TIMP-1, было в 3-4 раза меньше (см. рис. 3, г), и они были склонны образовывать небольшие скопления в зоне остеоинтеграции (см. рис. 1, г). Обсуждение полученных данных. Как известно, остеоинтеграция включает в себя широкий спектр явлений, в том числе аппозицию клеток, инвазию сосудов, формирование кости de novo и ее созревание, чтобы достичь в итоге первичной и вторичной стабильности внутрикостных имплантатов [12, 17]. В этом комплексе процессов MMP-9, к секреции которой способны макрофаги, остеокласты и молодые клетки остео-и хондрогенного ряда, призвана растворять низкоминерализованные компоненты смешанного матрикса молодых растущих и регенерирующих опорных тканей. Этим обеспечивается возможность доступа новых остеобластов и остеокластов, а также эндотелиальных клеток в зону ремоделирования и оссификации. ММР также регулируют баланс цитокинов и факторов роста в зоне регенерации [15]. TIMP-1, секретируемый клетками остеогенного ряда, рассматривается в качестве основного функционального антагониста в этих процессах, обеспечивая интенсивность ремоделирования костной ткани и очередность смены фаз при регенерации в области повреждения [11, 16]. Наличие в зоне остеоинтеграции большего количества (по сравнению с контролем) клеток с высокой экспрессией MMP-9 и TIMP-1 при соотношении 3,5:1 для групп с использованием и без использования материала, содержащего rhBMP-2, свидетельствует об активации процессов ремоделирования костной ткани в области остеоинтеграции при использовании одновременно с имплантацией материала «Gamalant™-паста-ФОРТЕ Плюс», содержащего rhBMP-2. В результате исследования установлено усиленное ремоделирование ткани не только непосредственно в зоне остеоинтеграции, но ивприлегающей губчатой кости. Совершенно очевидно, что остеоиндуктивный эффект rhBMP-2, находящегося в тканевом депо вокруг имплантата, распространяется довольно далеко за пределы собственно зоны остеоинтеграции. По современным представлениям, для обеспечения долговечности функционирования имплантата необходимо не только формирование плотной зоны остеоинтеграции, но и адекватное ремоделирование окружающей губчатой кости, адаптирующейся таким образом к новым амплитудам и векторам нагрузок [12]. Без этого процесса после приложения нагрузок неизбежны микропереломы, расшатывание и отторжение имплантата. Полученные результаты экспериментального исследования свидетельствуют о том, что предварительное внесение материала, содержащего фактор роста rhBMP-2, в костный канал перед постановкой титановых имплантатов с ТКПБП сопровождается дополнительным остеоиндуктивным эффектом, в результате чего улучшаются морфологические показатели остеоинтеграции. Наблюдаются более интенсивное и опережающее по срокам новообразование костной ткани в зоне остеоинтеграции, а также ремоделирование и уплотнение прилежащей губчатой кости. В ранние сроки имплантации обеспечивается оптимальный баланс между специфической матриксной металлопротеиназой-9 и ее тканевым ингибитором при высоком уровне экспрессии каждого компонента, что способствует значительной интенсивности процесса остеоинтеграции имплантатов.

About the authors

N. M. Gaifullin

M.V.Lomonosov Moscow State University

Email: gaifulin@rambler.ru
Department of Physiology and General Pathology

A. S. Karyagina

N. F.Gamaleya Scientific Research Center of Epidemiology and Microbiology

Email: akaryagina@gmail.com
Laboratory of Biologically Active Nanostructures

A. V. Gromov

N. F.Gamaleya Scientific Research Center of Epidemiology and Microbiology

Email: gro_msu@mail.ru
Laboratory of Biologically Active Nanostructures

A. A. Terpilovskiy

Laboratory of Virtual Biology

Email: alexdies@mail.ru

D. A. Malanin

Volgograd State Medical University

Email: malanin67@mail.ru
Department of Traumatology and Orthopedics

M. V. Demeshchenko

Volgograd State Medical University

Email: maximus275@yandex.ru
Department of Traumatology and Orthopedics

V. V. Novochadov

Volgograd State University

Email: novovv@rambler.ru
Department of Bioengineering and Bioinformatics

References

Supplementary files