INTRANUCLEAR ACCUMULATION OF Iba-1 PROTEIN IN MICROGLIOCYTES OF THE HUMAN BRAIN

Full Text

Микроглия - одна из наименее изученных популяций глиальных клеток головного мозга. Несмотря на общепризнанную роль этих клеток в развитии воспалительного процесса, репарации и регенерации нервной ткани, механизмы их активации, их нейротоксического и нейропротекторного действия остаются во многом неизученными. Мало понятна и роль белка Iba-1 - одного из микроглиальных маркеров [1] в регуляции и осуществлении многообразных функций микроглиоцитов. Хотя этот белок был выявлен и охарактеризован еще в 1996 г. [4], до настоящего времени существуют противоречия в представлениях о его идентичности ряду других макрофагальных белков [1], что вносит неопределенность в трактовку результатов многочисленных исследований, выполненных с использованием антител к этому белку. Недавно было обращено внимание на присутствие белка Iba-1 в ядре микроглиоцитов черного вещества головного мозга человека [3], однако представленные данные не могут считаться в полной мере доказательными, поскольку использованные методы световой микроскопии не позволяют четко разграничить ядерный и цитоплазматический компартменты изучавшихся клеток. Цель настоящего исследования состояла в уточнении факта присутствия белка Iba-1 в ядрах микроглиоцитов с использованием методов иммуноцитохимии и конфокальной лазерной микроскопии. Материал и методы. Исследованы кора большого мозга, стриатум, черное вещество, красное ядро у людей 25-78 лет (n=18). Использован материал из архива лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы Института экспериментальной медицины. Программа исследований имеет положительное заключение локального этического комитета ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН. Материал, хранившийся в виде парафиновых блоков, был фиксирован в цинк-этанол-формальдегиде, обезвожен и залит по общепринятой методике. Срезы толщиной 5-10 мкм готовили с помощью санного микротома Leica SM2000R (Leica, Германия) и наклеивали их на предметные стекла с фабричным адгезивным покрытием - HistoBond (Marienfeld, Германия). После стандартной процедуры депарафинирования и регидратации проводили тепловое демаскирование антигена. Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы инкубировали в 3% растворе перекиси водорода, а для блокирования неспецифических участков связывания антигена - в блокировочном растворе (Protein Block, Spring Bioscience, США). Клетки микроглии выявляли при помощи поликлональных козьих антител к белку Iba-1 (разведение 1:200, Abcam, Великобритания). Для выявления комплекса антиген-антитело применяли вторичные антикозьи биотинилированные антитела (разведение 1:200, Dako, Дания). Для визуализации продукта иммуноцитохимической реакции при световой микроскопии использовали стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой (Spring Bioscience, США), и хромоген DAB+ (Dako, Дания). Ядра докрашивали гематоксилином. Препараты исследовали под микроскопом Leica DM750, фотосъемку выполняли с помощью фотокамеры ICC50 (Leica, Германия). Для флюоресцентной визуализации продукта иммуноцитохимической реакции использовали стрептавидин, конъюгированный с флюорохромом Cy2 (Jackson ImmunoResearch, США). Ядра клеток докрашивали флюоресцентным красителем йодистым пропидием (PI). Полученные препараты исследовали при помощи конфокального лазерного микроскопа LSM 710 (Zeiss, Германия), укомплектованного аргоновым и твердотельным лазерами. Обработку полученных изображений и трехмерную реконструкцию проводили с помощью компьютерных программ Zen-2011 (Zeiss, Германия). Был использован объектив Plan-Apochromat 100x/1.40 Oil-DIC M27 (масляная иммерсия). Для возбуждения флюоресценции Cy2 и PI использовали лазеры с длиной волны 488 и 561 нм соответственно. Для обеспечения независимого возбуждения флюоресценции красителей и исключения возможности перекрытия их спектров эмиссии использовали рекомендованный производителем оборудования режим «Best Signal». В работе использовалось оборудование, предоставленное в соответствии с программой «Протеом человека» РАН. Результаты исследования. При использовании иммунопероксидазной реакции на белок Iba-1 было обнаружено, что во всех исследованных областях мозга селективно выявились отростчатые клетки, имеющие морфологические признаки микроглиоцитов. Кроме типичных микроглиоцитов, в препаратах присутствовали единичные удлиненные и овальные иммунопозитивные клетки, которые располагались периваскулярно (периваскулярные макрофаги). Исследование препаратов с использованием иммерсионного объектива 100 позволило выявить неравномерность в распределении продукта иммуногистохимической реакции в ядрах микроглиоцитов (рисунок). Приблизительно в половине наблюдаемых клеток обнаруживалась ярко окрашенная крупная гранула (реже - более мелкие 2-3 гранулы) на фоне сравнительно слабо окрашенной нуклеоплазмы. В ядрах других микроглиоцитов продукт иммуногистохимической реакции был мелкогранулярным, и его локальной концентрации не наблюдалось. Встречались единичные микроглиоциты как с высокоинтенсивной реакцией оценить состояние ядра, так и с почти неокрашенным (иммунонегативным) ядром. Подобные особенности распределения продукта иммуногистохимической реакции были характерны для всех изученных областей мозга, но больший полиморфизм был характерен для стриатума и черного вещества. Изучение препаратов с использованием конфокального лазерного микроскопа показало, что в ядрах части микроглиоцитов действительно наблюдается накопление белка Iba-1 (см. рисунок, г), причем это было характерно для клеток с достаточно крупными для микроглиоцитов ядрами (около 5 мкм в диаметре). Сравнительный анализ графиков интенсивности флюоресценции красителей, использованных для маркирования Iba-1 (Cy2) и ДНК/РНК (PI), показал следующее: Яркая гранула (диаметром до 1,5 мкм), соответствующая внутриядерному скоплению Iba-1, не ассоциирована с глыбками гетерохроматина. Часть внутриядерного Iba-1, распределенного в ядре вне ярко окрашенной гранулы, обнаруживается как в зонах эухроматина, так и гетерохроматина. В ядре микроглиоцитов встречаются участки, в которых Iba-1 отсутствует. Обсуждение полученных данных. В ходе проведенного исследования удалось доказать, что в ядрах микроглиоцитов головного мозга действительно содержится белок Iba-1. При этом накопление белка в одном из ядерных компартментов не соответствует ни ядрышку, ни особому скоплению гетерохроматина. Такое заключение можно сделать, исходя из незначительного уровня флюоресценции йодистого пропидия (неселективно связывающего ДНК/РНК красителя [2]) в области максимальной флюоресценции Су2, связанного с Iba-1. Причины локализации белка Iba-1 в ядре микроглиоцитов неясны. Не исключено, что этот белок, помимо своей основной функции - принятия участия в фагоцитозе [1], может выступить и в роли транскрипционного фактора. Необычным является и то, что локальные внутриядерные скопления белка Iba-1, по-видимому, не характерны для микроглиоцитов головного мозга лабораторных животных [5]. Таким образом, установлено, что белок Iba-1 действительно присутствует в ядрах микроглиоцитов головного мозга человека. При этом обнаружена локальная концентрация внутриядерного Iba-1 с формированием белковых агрегатов вне отчетливой ассоциации с гетерохроматином ядра. Данный факт нуждается в дальнейшем изучении с целью прояснения его функциональной значимости.

About the authors

D. E. Korzhevskiy

RAS Research Institute of Experimental Medicine; St. Petersburg State University

Email: dek2@yandex.ru
Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology; Department of Fundamental Problems of Medicine and Medical Technology

O. V. Kirik

RAS Research Institute of Experimental Medicine

Email: olga_kirik@mail.ru
Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

O. S. Alekseyeva

RAS Research Institute of Experimental Medicine

Email: osa72@inbox.ru
Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

Ye. G. Sukhorukova

RAS Research Institute of Experimental Medicine

Email: len48@inbox.ru
Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

M. A. Syrtsova

RAS Research Institute of Experimental Medicine

Email: marina.syrczova@mail.ru
Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

References

Supplementary files