LOCALIZATION OF ALPHA-SYNUCLEIN IN RAT BRAIN AND ITS INTERRELATION WITH THE DOPAMINERGIC STRUCTURES

Full Text

Альфа-синуклеин (α-Syn) широко распространен в мозгу. Он составляет приблизительно 0,5-1% от массы общего цитозольного белка и является основным компонентом телец Леви - патологических нейрональных включений, обнаруживаемых при болезни Паркинсона (БП) и других нейродегенеративных заболеваниях, объединяемых по этому признаку в группу синуклеинопатий; также он входит в состав сенильных бляшек, характерных для болезни Альцгеймера [4, 7]. С накоплением α-Syn в мозгу могут быть связаны ранние проявления когнитивных расстройств первично-дегенеративного генеза [3]. Мутации в гене, кодирующем α-Syn (SNCA), обнаружены при ряде наследственных форм БП, причем в этих случаях чаще всего заболевание проявляется в молодом возрасте и протекает довольно агрессивно [2, 4]. В норме в нейронах выявлена ядерная и пресинаптическая локализация α-Syn, а также растворимая и мембрано-связанные формы [7]. Показана ассоциация α-Syn с митохондриями, синаптическим везикулярным аппаратом и обнаружены его сплайсинговые варианты и фосфорилированные формы [4, 7]. Выявлена зависимость патологической агрегации α-Syn от его фосфорилирования [4, 7]. Вероятно, в связи с разнообразием форм α-Syn иммуногистохимические данные о его локализации в нервной системе значительно различаются в зависимости от распознаваемых антителами эпитопов. Так, при сопоставлении двух антител, выработанных к разным участкам молекулы α-Syn, было обнаружено, что в одном случае они связывались с ядерной, в другом - с синаптической фракцией белка [22]. Роль α-Syn в нейродегенерации связывают с его предрасположенностью к формированию фибрилл, образующих нерастворимые агрегаты, по прионо-подобному механизму, когда «затравкой» служит молекула c патологической конформацией [4, 8, 7]. Фибриллы α-Syn могут переноситься по аксону как в прямом, так и обратном направлении [6]. Распространение агрегатов α-Syn от нейрона к нейрону подтверждено как in vitro, так и in vivo [14]. По-видимому, образование телец Леви и дегенерация нейронов при БП на ранних стадиях заболевания начинается в периферической нервной системе, захватывая затем отделы ЦНС, в том числе дофаминергические структуры среднего мозга [8]. В качестве точек проникновения предполагаемого патогена, вызывающего агрегацию белка, называют обонятельный эпителий и пищеварительный тракт [8]. Рассматривают различные пути распространения патологических форм α-Syn в структуры мозга [8, 21], в том числе в каудо-ростральном направлении по блуждающему нерву, и рострокаудально - через структуры обонятельного анализатора, а также по спинальным проводящим путям, однако точно это еще не установлено. Несмотря на возрастающий интерес к α-Syn, работы, посвященные анализу его распределения в интактном мозгу, немногочисленны, причем отмечаются расхождения в результатах, связанные со специфичностью антител и возможными межлинейными и видовыми различиями лабораторных животных [12, 17, 20, 22]. Цель данной работы - изучить и сопоставить локализацию α-Syn и тирозингидроксилазы (ТГ) в ЦНС у интактных крыс. Материал и методы. Исследование выполнено на крысах-самцах линии Вистар массой 300-350 г. Использовали интактных животных (n = 5), и животных (n = 3) через 4 нед после одностороннего стереотаксического введения (стереотаксический манипулятор, Stoelting, США) 6-гидроксидофамина гидрохлорида (6-OHDA, Sigma-Aldrich, США), 6 мкг в 3 мкл 0,05% раствора аскорбиновой кислоты в черное вещество среднего мозга [5]. При работе соблюдали «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных». Крыс наркотизировали хлоралгидратом и декапитировали гильотиной. Мозг и хрящи, формирующие полость носа, фиксировали 24 чв 4% нейтральном формалине на фосфатном солевом буфере (0,01М, pH 7,2). Структуры полости носа после фиксации промывали и декальцинировали 14 сут в 10% растворе ЭДТА-Na (доведенный 10 N NaOH до pH 7,2-7,4). Срезы толщиной 10-15 мкм готовили на криотоме Tissue-Tek Sakura Cryo3 (Япония) и раскладывали на покрытые желатином стекла. Для демаскировки антигена срезы выдерживали 5 мин в микроволновой печи при температуре 90-95 ºC, в цитратном буфере (0,01М, pH 6,0), после остывания их промывали и обрабатывали 10 мин 0,03% H2O2. Растворы антител готовили на фосфатном солевом буфере (0,01М, pH 7,2), содержавшем 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% Тритона X100. Антитела к α-Syn (кроличьи, поликлональные, S3062, Sigma-Aldrich, США) применяли в разведениях 1:200-1:500, антитела к ТГ (кроличьи поликлональные, T8700, Sigma-Aldrich, США) - в разведениях 1:500-1:1000 и инкубировали 18 ч при комнатной температуре. Для каждой серии препаратов выполняли негативный контроль. Связывание выявляли при помощи биотинилированных антител козы к иммуноглобулинам кролика и экстравидин-пероксидазы (набор EXTRA3KIT, Sigma-Aldrich, США), по протоколу производителя. В качестве хромогена использовали 3,3-диаминобензидин с 0,01% CoCl2 или NiCl2, а для реакции на ТГ без солей металлов. Препараты заключали в среду DPX (Surgipath Europe, Великобритания) и исследовали под микроскопом Leica DMLB с цифровой камерой Leica DC300 (Leica, ФРГ), или под стереомикроскопом Motic SMZ-161, камера Moticam 5 (Motic, КНР). Структуры мозга идентифицировали по стереотаксическому атласу [19]. Результаты исследования. При проведенном иммуногистохимическом исследовании диффузное окрашивание нейропиля, отражающее синаптическую локализацю α-Syn, было обнаружено во всех отделах мозга у интактных животных (рис. 1), но наибольшая иммунореактивность выявлена в конечном мозгу. В неокортексе α-Syn был распределен неравномерно, наиболее интенсивно окрашивались слой IV и молекулярный слой. Диффузное окрашивание было характерно для базальных ядер, при этом вентральный паллидум отличался наибольшей его интенсивностью. Мозолистое тело, передняя спайка и внутренняя капсула не окрашивались. Структуры, входящие в состав обонятельного мозга: обонятельные луковицы, обонятельный бугорок и пириформная кора, - окрашивались интенсивно. В разных слоях гиппокампа экспрессия α-Syn различалась, а наибольшей была в мшистых волоконах в поле CA3 и в молекулярном слое зубчатой извилины. Миндалевидное тело также отличалось высоким содержанием α-Syn с наибольшим окрашиванием в центральном ядре. В промежуточном мозгу распределение α-Syn было неравномерным: интенсивное окрашивание было отмечено в дорсальных ядрах таламуса, умеренное - в латеральном и медиальном коленчатых телах, слабое - в субталамическом ядре. В гипоталамусе α-Syn, локализованный в синаптических окончаниях, был выявлен в вентральной и латеральной областях, причем в латеральном и среднебугорно-сосцевидном ядрах обнаружены и окрашенные нейроны. В среднем мозгу наиболее высокая экспрессия α-Syn была выявлена в ретикулярной части черного вещества, и умеренная - в вентральной покрышечной области и в центральном сером веществе. В мозжечке α-Syn располагался диффузно в зернистом и молекулярном слоях, но не в слое клеток Пуркинье. В стволе мозга наиболее интенсивное окрашивание при реакции на α-Syn было обнаружено в околоручковых ядрах, голубоватом месте, ядре одиночного пути, дорсальном ядре блуждающего нерва и двойном ядре; в этих структурах, кроме того, были выявлены окрашенные нейроны. На уровне грудных сегментов спинного мозга наибольшей экспрессией белка отличались задние рога (слои I-III по Рекседу). Хотя α-Syn, выявляемый в синаптических окончаниях, был широко распространен в мозгу, его соматическую локализацию наблюдали, как правило, в нейронах дофамин-или норадренергических ТГ-позитивных структур. Нейроны, содержащие α-Syn, располагались в компактной части черного вещества, в вентральной покрышечной области, голубоватом месте и дорсальном ядре блуждающего нерва. При этом соматическая локализация α-Syn отмечалась не во всех дофаминергических нейронах черного вещества (см. рис. 1). В целом характер распределения ТГ и α-Syn в базальных ядрах различался (см. рис. 1) - хвостатое ядро окрашивалось интенсивно как при реакции на ТГ, так и на α-Syn, а в бледном шаре выявлялись только отдельные волокна, содержащие ТГ, тогда как α-Syn в нем был распределен диффузно. Ретикулярная часть черного вещества, содержащая мало ТГ-позитивных нейронов и волокон, вместе с тем интенсивно окрашивалась при реакции на α-Syn. Для проверки предположения об отсутствии α-Syn в нигростриатных дофаминовых окончаниях мы исследовали его экспрессию при одностороннем разрушении черного вещества под действием 6-OHDA (рис. 2). В полосатом теле, на стороне введения токсина, ТГ не выявлялся, однако реакция на α-Syn в базальных ядрах оставалась неизменной, что указывает на отсутствие α-Syn в дофаминергических окончаниях. α-Syn был обнаружен в обонятельном эпителии, в цитоплазме и апикальных отростках сенсорных обонятельных нейронов, но он отсутствовал в клетках базального слоя, в поддерживающих клетках и в респираторном эпителии (рис. 3). Пучки нервных волокон в собственной пластинке слизистой оболочки носа были интенсивно окрашены, хотя в обонятельном нерве на уровне обонятельных луковиц α-Syn выявлен не был. В гломерулярном слое обонятельных луковиц экспрессия α-Syn была наиболее высокой, но не однородной - часть гломерул имели слабое или умеренное окрашивание, а наружный плексиформный слой при реакции на α-Syn окрашивался диффузно. Распределение ТГ и α-Syn в обонятельных луковицах различалось: ТГ была обнаружена в перигломерулярных клетках и их отростках, тогда как α-Syn выявлен только в гломерулах. Другие структуры центрального отдела обонятельного анализатора: переднее обонятельное ядро, обонятельные бугорки и пириформная кора - также содержали α-Syn, причем из этих структур лишь обонятельный бугорок имел значительную экспрессию ТГ. Обсуждение полученных данных. Проведенное исследование показало, что локализация α-Syn в мозгу у крыс линии Вистар в целом сопоставима с результатами, полученными на крысах Sprague-Dawley [12] и мышах линии C57Bl/ J6 [20]. Однако, по нашим данным, в отличие от ряда авторов [17, 22], распространение нейронов, содержащих α-Syn в структурах мозга, было довольно ограничено, и данный белок не выявлялся в их ядрах. Локализация α-Syn была лишь отчасти ассоциирована с дофаминергическими образованиями нигростриатной и обонятельной систем, хотя структуры, вовлекаемые в патологический процесс при БП, отличались наибольшей его экспрессией, что согласуется с исследованиями, демонстрирующими зависимость образования телец Леви от концентрации α-Syn [16]. Пресинаптический α-Syn ранее был выявлен в глутаматергических и ГАМК-ергических окончаниях [20], что подтверждается и нашим исследованием. Проведенный нами эксперимент с односторонним разрушением черного вещества под действием 6-OHDA выявил различия в распределении ТГ и α-Syn в структурах нигростриатной системы, свидетельствующие, что синаптический α-Syn в полосатом теле относится к кортикостриатным окончаниям. Интенсивное окрашивание при реакции на α-Syn структур бледного шара и ретикулярной части черного вещества и слабое их окрашивание в субталамическом ядре указывают на экспрессию α-Syn нейронами, образующими прямой стрио-нигральный путь, что согласуется с данными литературы [20]. Как следует из полученных результатов, α-Syn, по-видимому, локализуется в телах и синаптических окончаниях разных популяций нейронов. В телах нейронов α-Syn обнаруживали в катехоламинергических структурах: черном веществе, голубоватом месте и дорсальном (моторном) ядре блуждающего нерва, подверженных нейродегенерации при БП [8]. Предполагают, что ядра блуждающего нерва служат начальной мишенью ретроградного распространения агрегатов α-Syn из периферической нервной системы в головной мозг [8]. Однако при синуклеинопатиях агрегация α-Syn выявляется не только в дофаминергических и норадренергических структурах, но и в неокортексе, гиппокампе, миндалевидном теле, сосцевидных ядрах гипоталамуса и структурах обонятельного анализатора [8, 11], что совпадает с обнаруженной в них высокой экспрессией α-Syn в норме. Повреждение упомянутых структур связывают с рано проявляющимися при БП вегетативными и обонятельными нарушениями и когнитивной дисфункцией [1, 8, 11]. Структуры обонятельного анализатора и их связи с лимбической системой и вентральной покрышечной областью среднего мозга образуют другой вероятный путь распространения α-Syn при БП. Выявленная в нашей работе экспрессия α-Syn сенсорными обонятельными нейронами была ранее описана у человека [9], кроме того, мы выявили локализацию α-Syn в пучках волокон иннервирующих эпителий полости носа и следующих в составе ветвей тройничного нерва [13]. Литературные данные об изменениях нервных элементов обонятельного эпителия при БП противоречивы [8, 23], хотя наличие телец Леви на ранних стадиях БП в обонятельных луковицах отражено в многочисленных работах [21]. Высокое содержание α-Syn в обонятельных гломерулах может быть связано с его наличием в синаптических окончаниях обонятельных нейронов или митральных клеток. В то же время не все гломерулы содержат α-Syn, возможно, в связи с разным уровнем экспрессии этого белка в обонятельных нейронах, поскольку отростки однотипных сенсорных нейронов приходят в одну гломерулу [13]. Выявленное распределение α-Syn в гломерулах может указывать на уязвимость отдельных типов обонятельных нейронов при БП, что может быть причиной нарушения распознавания запахов [1]. Точная причина обонятельных нарушений при БП не установлена [21]. Роль дофамина в обонянии подтверждается экспериментами с повреждением дофаминовых нейронов черного вещества [21], но при БП могут иметь значение и нарушения периферической иннервации обонятельного эпителия, предположительно модулирующей активность сенсорных нейронов [13]. Снижение обоняния при БП также связывают с дисфункцией перигломерулярных дофаминовых нейронов [15]. В то же время было показано увеличение числа ТГ-позитивных нейронов обонятельных луковиц при БП [18]. Отсутствие, по нашим данным, α-Syn в телах перигломерулярных клеток может быть связано с их устойчивостью к нейродегенерации при БП. Среди ключевых структур предполагаемого ольфакторного пути распространения α-Syn при БП указывают на переднее обонятельное ядро [8, 21], а также на обонятельный бугорок и пириформную кору, богатые α-Syn и имеющие многочисленные связи, в том числе с дофаминергическими образованиями среднего мозга [21]. С другой стороны, недавно описанные прямые дофаминергические нигро-ольфакторные проекции [10], по-видимому, имеют важное значение для ретроградного распространения α-Syn из обонятельных структур в средний мозг. Таким образом, в базальных ядрах головного мозга у крыс линии Вистар α-Syn локализован в пресинаптических кортико-стриатных и стрионигральных, но не в нигро-стриатных окончаниях. Его высокое содержание выявлено и в лимбической системе и структурах обонятельного мозга. В телах нейронов α-Syn обнаруживается в дофамин-и норадренергических структурах подверженных нейродегенерации при БП: черном веществе, голубоватом месте и дорсальном ядре блуждающего нерва, а также выявляется в сенсорных обонятельных нейронах. В целом локализация α-Syn лишь отчасти ассоциирована с дофаминергическими структурами мозга, однако полученные нами данные поддерживают гипотезу о периферическом начале БП и указывают на важную роль структур обонятельного анализатора в распространении патологических агрегатов α-Syn в головном мозгу.

About the authors

D. N. Voronkov

Research Center of Neurology

Email: voronkovdm@gmail.com

R. M. Khudoyerkov

Research Center of Neurology

Email: rolfbrain@yandex.ru

O. V. Sal’nikova

Research Center of Neurology

Email: fial88@mail.ru

V. B. Sobolev

Research Center of Neurology

Email: sobolevalera@gmail.com

References

Supplementary files