DISTRIBUTION OF HEME-OXYGENASES IN THE WALLS OF THE PIA MATER ARTERIES IN RAT BRAIN

Full Text

В ЦНС монооксид углерода (СО) играет важную роль, обеспечивая эффект долговременной синаптической потенциации, обучение, ноцицептивную сигнализацию, память и ряд других функций [8, 10, 16, 17]. На этом основании считалось, что распространение СО в мозгу ограничивается нейронами, глией и отдельными капиллярами [2, 6-8]. В последние годы появились сообщения, позволяющие рассматривать эту сигнальную молекулу в качестве ключевого звена в кардиоваскулярной патологии, при которой газ может выступать как аутокринный и/или паракринный регулятор вазомоторики, оказывая на резистивные сосуды не столь мощное, как оксид азота, но более длительное действие [6, 12, 21]. Субстратом для эндогенного образования СО является молекула гема, продукция которого в организме катализируется в основном двумя изоформами гемоксигеназы: 1 (ГО-1), являющейся индуцибильной формой энзима, и 2 (ГО-2) - ее конститутивной формой [16, 17]. Сведения о функциональных свойствах и распределении этих ферментов в церебральных артериях ограничены и крайне противоречивы. По одним данным, экспрессия ГО-1 и ГО-2 в стенке артерий мягкой оболочки (МО) головного мозга наблюдается постоянно [16], по другим - индукция ГО-1 в них происходит только под влиянием стрессорных факторов [11, 13], а в артериях легких, почек, брыжейке при гипертензии и воспалительных заболеваниях [13, 18-21]. Столь же неопределенные сведения имеются и о топохимии ГО-1 и ГО-2 в стенке крупных и мелких артерий МО [9]. Цель данной работы - изучение локализации ГО-1 и ГО-2 в стенке артерий МО головного мозга разного калибра у крыс в обычных условиях жизнедеятельности организма и при развитии гипертензии. Материал и методы. Исследование выполнено на 40 крысах-самцах линии Вистар массой 200-240 г.: 35 - с вызванной реноваскулярной гипертензией (РВГ), у которых артерии МО изучали через 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 нед после операции (по 5 животных в каждой группе) и 5 -ложно оперированных животных (контрольная группа - КГ) с показателями артериального давления (АД) 110±3 мм рт. ст. Всех крыс содержали на стандартном рационе в одинаковых условиях лабораторного вивария. Систолическое давление измеряли при помощи системы неинвазивного мониторирования ML U/4c501 методом хвостовой манжеты (MedLab). Животных усыпляли внутрибрюшинным введением 3% раствора тиопентала натрия, после чего декапитировали. Объектом исследования служили ветви I-V порядков бассейна средней мозговой артерии диаметром: 108-86 мкм, 74-46 мкм, 42-34 мкм, 30-12 мкм, 10-8 мкм соответственно. Экспериментальные манипуляции проводили в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Для иммунногистохимического выявления гемоксигеназ мозг вместе с сосудами мягкой оболочки фиксировали в течение 1 ч в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) при 4 °С. Из кусочков мозга готовили серийные криостатные срезы толщиной 20 мкм, один из которых обрабатывали для иммуногистохимического выявления ГО-1, следующий за ним - ГО-2. После этого срезы последовательно инкубировали в 1% нормальной сыворотке лошади 1 ч при комнатной температуре (Abcam, Bеликобритания), затем либо с мышиными моноклональными антителами к ГО-1 в разведении 1:100 (Abcam, Bеликобритания), либо мышиными моноклональными антителами к ГО-2 (Abcam, Bеликобритания) в разведении 1:1000 при температуре 4 °С в течение 18 ч, с биотинилированными антителами лошади к IgG мыши в разведении 1:100 (Vestor Labs, США) 2 ч и с авидин-пероксидазным комплексом (Vectastain Elite ABC Kit, Vestor Labs, США) 1 ч при комнатной температуре. Для выявления продуктов реакции под контролем микроскопа срезы инкубировали в субстрате для обнаружения пероксидазы (VIP Substrate Kit, Vestor Labs, США). Затем срезы промывали, обезвоживали по стандартной методике и заключали в полистерол. Для оценки специфичности реакции проводили окрашивание отдельных срезов без первичных или вторичных антител. На контрольных срезах иммунопозитивная реакция отсутствовала. У каждого животного вычисляли долю энзимпозитивных сосудов от общего числа встретившихся сосудов соответствующего порядка ветвления (диаметра) по опубликованной ранее методике [1]. Локализацию ферментов исследовали не менее чем на 5 последовательных срезах сосудов каждой размерной группы. Значимость различий оценивали по t-критерию Стьюдента. Критическим ее уровень считали при p<0,05. Результаты исследования. У крыс КГ в стенке артерий МО головного мозга иммуногистохимический маркер ГО-1 не определялся, тогда как экспрессия ГО-2 наблюдался в артериальных ветвях I-V порядков (рис. , а-в). В этих случаях мелкогранулярный осадок коричневого цвета откладывался в структурных компонентах стенки сосудов, окрашивая их в зависимости от плотности отложения преципитата, в различные оттенки коричневого цвета. Локализация и обильность продукта реакции во многом зависели от калибра сосудов. В ветвях I-II порядка с многослойной средней оболочкой плотный гранулярный осадок, маркирующий ГО-2, определяется преимущественно в миоцитах (см. рис. , а), в ветвях III порядка диаметром около 40 мкм экспрессия фермента, наряду с гладкими миоцитами, наблюдались в эндотелии (см. рис. , б, в). Доля сосудов с иммунопозитивным эндотелием среди ветвей I-II порядка в 2-3 раза была ниже, чем среди ветвей III порядка (Р<0,05), в которых продукт реакции одинаково часто откладывался в сократительных клетках и эндотелии (рис. 2, а). В ветвях IV-V порядков диаметром менее 30 мкм, имевших один, зачастую непостоянный, слой гладких миоцитов, маркер ГО-2 определялся преимущественно в эндотелии (см. рис. , г, д). На долю таких артерий приходилось около 30%, тогда как среди ветвей I-II порядка с ГО-2-позитивным эндотелием было не более 5-7% (см. рис. 2, а). У крыс с гипертензией не установлено отличий локализации ГО-2 в стенке сосудов соответствующих размерных групп по сравнению с КГ. В первые 6 нед РВГ значимых преобразований числа крупных и мелких сосудов с экспрессией ГО-2 также не наблюдалось (Р>0,05), хотя АД в этот период более чем на 1/3 был выше, чем у крыс КГ (см. рис. 2, б). Однако в процессе дальнейшего развития гипертензии содержание ГО-2-позитивных сосудов быстро сокращалось. Выраженность отмеченных изменений зависела не только от продолжительности гипертензии и величины АД, но и порядка ветвления (диаметра) сосудов (см. рис. 2, в). На 8-й неделе РВГ доля иммунопозитивных артерий ветвей I-II порядков в МО снижалась на 16-14% по сравнению с таковой в КГ (P<0,05), тогда как соответствующие изменения среди ГО-2-позитивных ветвей IV-V порядков проходили между 10-12 нед РВГ, когда АД достигало наиболее высоких цифр (см. рис. 2, б). Затем, до окончания срока наблюдений, АД, как и доля ГО-2-позитивных ветвей I-III порядков, с небольшими колебаниями удерживались на постоянном уровне. В то же время число более мелких иммунопозитивных артерий продолжало сокращаться и между 14-16-й неделями РВГ достигало минимальных значений, после чего стабилизировалось (см. рис. 2, в). Иная динамика была отмечена в отношении ГО-1, маркеры которой впервые определялись в стенке артерий МО мозга между 4-8-й неделями РВГ. Экспрессия ГО-1 чаще всего наблюдалась в гладких миоцитах ветвей артерий I-III порядков, а в более мелких сосудах - преимущественно в эндотелии (см. рис. 1, е-к). В этих случаях желтовато-коричневые пылевидные гранулы маркировали отдельные миоциты и внутреннюю выстилку сосудов по большей части периметра. Однако постоянно и в достаточном для статистического анализа количестве ГО-1-позитивные сосуды определялись только между 10-12-й неделями РВГ (Р<0,05). Их содержание увеличивалось до 16-й недели, после чего существенно не менялось (см. рис. 2, в). Обсуждение полученных данных. Еще не так давно участие газотрансмиттеров в регуляции тонуса сосудов в физиологических условиях и при патологии рассматривалось исключительно в зависимости от наличия и концентрации в стенке сосудов оксида азота (NO) [4-6]. В последние годы появляются данные, свидетельствующие о том, что NO участвует в реализации быстрых, мощных, но непродолжительных реакций сосудов, тогда как СО способен обеспечить не столь выраженный, но долговременный эффект [3, 9, 12]. Тем не менее данных о наличии и распределении ферментов, участвующих в продукции СО в артериях МО мозга, немного. В результате проведенного нами исследования установлено, что у КГ крыс ГО-2 выявляется в 36-49% артерий разного калибра МО мозга. В зависимости от порядка ветвления (диаметра) артерий МО ГО-2 может находиться в миоцитах, эндотелии или в тех и других структурах вместе. Впрочем, нередко утверждается, что распространение гемоксигеназы ограничивается или эндотелием [18], или исключительно миоцитами [14]. Действительно, с помощью обратной полимеразной реакции экспрессия ГО-2 установлена в миоцитах крупных артерий МО мозга, но не выявлена в их эндотелии. СО-опосредованные эффекты не исчезали и в деэндотелизированных сосудах: аорте, подвздошных и сонных артериях [9, 19]. На этом основании роль эндотелия в СО-зависимых реакциях этих артерий подвергалась сомнению. Не исключено, противоречия в оценке локализации гемоксигеназы в стенке артерий обусловлены тем, что для исследований были использованы либо крупные, либо мелкие артерии. Имеются данные, что функциональное значение мышечного и эндотелиального компонентов в артериях разного калибра существенно различается [3, 4, 15]. Установленные нами топохимиимические особенности ГО-2 в структурных элементах стенки артерий МО I-V порядков отражают эти различия. В ветвях I-II порядка МО, имеющих относительно хорошо развитую среднюю оболочку, регулирующая функция СО связана главным образом с гладкими миоцитами. В ветвях III-IV порядков вазомоторика обеспечивается продукцией этой сигнальной молекулы часто одновременно в миоцитах и эндотелии, что соотносится с особенно важной ролью этих сосудов в регуляции внутримозговой гемодинамики [3, 9], в более мелких артериях, в которых миоциты постоянного слоя не образуют, - в эндотелии. По современным представлениям, именно эндотелий играет ведущую роль в инициации вазодилятации, по крайней мере, мелких артерий [5, 18]. Любое проявление их активности связано с гиперполяризацией эндотелиоцитов, после чего электрический сигнал, генерируемый в этих клетках, через мио-эндотелиальные соединения передается миоцитам сосуда. Мишенями действия СО в миоцитах могут быть циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) и Са2+-активируемые калиевые каналы [14, 17]. СО увеличивает калий-зависимый ток, вызывая гиперполяризацию миоцитов и вазодилятацию. При блокировании цГМФ и Са2+-активируемых калиевых каналов СО-индуцированная вазорелаксация прекращается [3, 17, 20]. В отличие от ГО-2, экспрессия индуцибильной формы гемоксигеназы в артериях МО мозга у крыс КГ нами не установлена. Другим авторам не удалось обнаружить ГО-1 у нормотензивных крыс и мышей методом Вестерн-иммуноблоттинга, причем не только в артериях мозга, но и в артериях легких и почек [9, 13]. При экспериментальной гипертензии в ветвях артерий МО разного калибра выявляются обе изоформы гемоксигеназы. Однако динамика преобразований сосудов, маркированных каждым из этих ферментов, заметно различается. Так, количество ГО-2-позитивных сосудов резко уменьшается между 10-12-й неделями и достигает минимальных значений на 16-й неделе РВГ. В этот период среди иммунопозитивных артерий МО наиболее выражено сокращение доли мелких ветвей, констрикция которых вносит наиболее весомый вклад в развитие гипертензии [3, 4, 20]. Неслучайно, между 10-16-й неделями РВГ величина АД удерживается на особенно высоком уровне. Известно, что у животных с накаутом гена гемоксигеназы, а также при использовании ее специфических блокаторов продукция СО сокращается, что приводит к развитию стойкой гипертензии [12, 19]. Вазоконстрикция и повышение АД, наблюдающиеся при снижении концентрации этого газа, исчезают после введения доноров СО [7]. ГО-1-позитивные артерии начинают выявляться на 4-8-й неделе РВГ. В начале их немного, однако, к 16-й неделе существенно увеличивается и до конца наблюдений удерживается на постоянно высоком уровне. Возможно, благодаря экспрессии индуцибильной формы фермента в крупных артериях, количество которых в этот период возрастает особенно значительно, достигается стабилизация АД на новом уровне, поскольку ГО-1 обеспечивает более выраженный вазодилататорный эффект, чем с ГО-2 [3, 21]. Опубликованы материалы, в которых указано, что на 16-20-й неделе гипертензии по ходу артерий МО мозга образуются булавовидные утолщения, что свидетельствует о срыве механизма ауторегуляции и ремоделировании сосудов [5, 6]. В стенке сосудистых деформаций авторами установлена экспрессия индуцибильной NO-синтазы, способной в десятки раз увеличить концентрацию оксида азота, которому, как известно, принадлежит ключевая роль в развитии гипертрофии сосудистой стенки и ее инволютивных изменений. Нельзя исключить, что и ГО-1, способствуя усилению продукции СО в артериях МО, участвует не только в регуляции вазомоторики, но и в адаптивных перестройках стенки сосудов. Таким образом, у КГ животных в продукции СО принимает участие ГО-2, у гипертензивных - ГО-2 и ГО-1, экспрессия которых в зависимости от диаметра артерий может проходить в эндотелии и миоцитах. Наибольшее количество ГО-1-позитивных сосудов наблюдается в то время, когда число артерий МО, маркированных ГО-2, сокращается особенно значительно, что совпадает по времени со стабилизацией артериального давления на новом более высоком уровне.

About the authors

V. M. Chertok

Pacific Ocean State Medical University

Email: chertokv@mail.ru

A. Ye. Kotsyuba

Pacific Ocean State Medical University

Email: akotc@mail.ru

A. G. Chertok

Pacific Ocean State Medical University

References

Supplementary files