SPERM MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS IN YOUNG MEN: ASSOCIATION WITH MOTILITY

Full Text

Важную роль в оценке мужского репродуктивного потенциала играют морфологические характеристики сперматозоидов [1, 7, 8, 17, 18]. Сперматозоиды человека, в отличие от мужских гамет большинства видов животных, характеризуются большим морфологическим разнообразием и значительным числом атипичных форм. Например, у такого известного модельного объекта для биомедицинских исследований, как лабораторная мышь, доля атипичных сперматозоидов колеблется от 5 до 20% [2], у человека в эякуляте их более 80% [14, 17]. Морфологические аномалии зрелых сперматозоидов являются результатом сложного процесса их преобразований в ходе сперматогенеза. Доля сперматозоидов с морфологическими дефектами и специфическими структурными аномалиями может служить индикатором этого процесса и являться значимым предиктором успешного оплодотворения как in vivo, так и in vitro [4, 5, 7, 19]. Морфологические характеристики сперматозоидов определяют результаты применения вспомогательных репродуктивных технологий, основанных на IVF (in vitro фертилизация). На успешность применения метода интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в яйцеклетку (ICSI) практически не влияют изменения - подвижность и концентрация сперматозоидов в эякуляте, но имеют значение морфологические характеристики сперматозоидов и их отклонения от нормы [7]. Морфологические изменения сперматозоидов часто связаны с нарушением конденсации хроматина, акросомной реакции и фрагментацией ДНК [4, 5, 10, 11, 21, 22]. Высокая доля морфологически аномальных сперматозоидов и особенно дефекты акросомы влияют на выживаемость эмбрионов и благополучный исход беременности [7, 17, 18]. Формирование дефектов сперматозоидов интенсивно изучается, в том числе их связи с функцией. Морфологическая модель аномального сперматогенеза включает две категории: первая - это генетически детерминированные морфологические дефекты, вторая - вызванная факторами среды [17]. У некоторых мужчин среди морфологических дефектов сперматозоидов может преобладать какой-то один специфический тип с доказанной генетической детерминацией, например, отсутствие акросомы, синдром укороченного хвоста или макрозооспермия [7, 11, 12, 18]. Один из редких вариантов недостаточного развития акросомы, получивший название глобозооспермия (идентифицируется по укороченной округлой головке сперматозоида), ассоциирован с нарушением расположения хроматина и значительным повреждением целостности ДНК и может сопровождаться снижением фертильности вплоть до бесплодия [7, 9, 12]. Однако такие мутации, приводящие к мономорфной тератозооспермии, встречаются в человеческой популяции редко и составляют не более 1% у бесплодных мужчин [9]. Чаще всего нарушение процесса сперматогенеза, приводящее к тератозооспермии, обусловлено воздействием факторов среды, в таком случае в эякуляте присутствуют сперматозоиды с морфологическими дефектами в различных соотношениях. При некоторых патологических состояниях или при воздействии неблагоприятных факторов внешней среды встречаемость отдельных типов морфологических аномалий сперматозоидов может меняться. Например, повышенное количество удлиненных головок сперматозоидов наблюдается у мужчин, страдающих урогенитальными инфекциями [19] или варикоцеле [18, 23]. Чрезмерное употребление алкоголя, курение, ожирение и даже психологический стресс увеличивают количество морфологически аномальных сперматозоидов [6, 7, 10, 13, 16, 20]. Установлено влияние эколого-географических факторов на морфологические характеристики сперматозоидов [6, 14]. В совокупности данные свидетельствуют о том, что сперматозоиды чувствительны к воздействию различных факторов среды и оценка морфологических изменений сперматозоидов может являться надежным маркером потенциальной мужской фертильности, отражая в то же время влияние тератогенной компоненты окружающей среды. У человека данные о количестве нормальных сперматозоидов и с аномальными формами сильно различаются, поскольку существует проблема определения признаков морфологически «нормального» сперматозоида [7, 8, 18, 24]. Исследование сперматозоидов, взятых с внутреннего зева матки и с блестящей оболочки яйцеклетки, т. е. тех сперматозоидов, которые участвуют в оплодотворении, показало, что они морфологически более однородны, чем в эякуляте, и имеют биологические особенности, помогающие им преодолеть цервикальную слизь, являющуюся для них селективным барьером. Внешний вид таких сперматозоидов был принят за стандарт нормы, что помогло сформулировать так называемые «строгие тайгенбергские критерии», согласно которым сперматозоид считается нормальным, если его головка, средняя часть и хвост соответствуют по форме и размеру сперматозоидам, прошедшим через цервикальный барьер [17, 18, 24]. В настоящее время в качестве стандартной методологии принято руководство ВОЗ 2010 г., предлагающее унифицированную классификацию морфологических признаков «нормального» и аномального сперматозоида, основанную на подсчете сперматозоидов с отчетливо выраженными особенностями формы и размеров головки, средней части и хвоста [8, 24]. Применение этой классификации усилило прогностическое значение морфологического статуса сперматозоидов при использовании вспомогательных репродуктивных технологий искусственного оплодотворения [7]. Цель настоящего исследования состоит в анализе морфологических характеристик сперматозоидов и поиске связи между ними и их подвижностью, а также в сравнении частоты встречаемости различных морфологических дефектов сперматозоидов у мужчин с нормальным и ослабленным сперматогенезом. Материал и методы. Исследование проведено вг. Кемерово в конце марта-начале апреля 2013 г. на базе медицинского центра «Эргин». В нем участвовали мужчиныдобровольцы, студенты высших учебных заведений, желающие проверить свое репродуктивное здоровье. К исследованию допускались мужчины в возрасте 18-25 лет при условии отсутствия на момент исследования любых заболеваний в стадии обострения, воздержания от половых контактов и употребления алкоголя в течение 2-3 сут до обследования. Каждый мужчина был ознакомлен с методами и целями исследования, после чего дал письменное согласие на обследование. Все испытуемые заполняли стандартную анкету, которая содержала вопросы о возрасте, национальности, употреблении табака и алкоголя, образовании и профессии, перенесенных заболеваниях. Всего обследовано 111 мужчин, по национальному составу преобладали люди славянской этнической принадлежности (81,8%), средний возраст составил 21,5±0,2. Никто из испытуемых не имел детей. Физикальный осмотр испытуемых проводил врач андролог, в ходе осмотра выявляли симптомы заболеваний репродуктивной сферы, измеряли рост и определяли массу тела. Сбор и анализ эякулята проводили в соответствии с рекомендациями ВОЗ [24]. Концентрацию сперматозоидов в эякуляте определяли с помощью камеры Горяева после окраски аликвоты эякулята трипановым синим. Суммарную долю подвижных сперматозоидов категории А (с прогрессивным движением более 25 мкм/с) и B (с прогрессивным движением 2-25 мкм/с) оценивали с использованием анализатора основных показателей фертильности спермы SFA-500-2 (Биола, Россия). Исследование каждой пробы проводили трижды. Для подсчета сперматозоидов с морфологическими аномалиями мазки нативного эякулята высушивали, фиксировали в метаноле и окрашивали с использованием коммерческого набора Diff-Quick (Абрис+, Россия), который представляет собой патентованную товарную марку окрашивания по Романовскому (смесь метиленового синего и эозина). Анализ морфологических характеристик сперматозоидов проводили по «строгим критериям» нормы [17, 19, 24]. Анализировали первые 200 сперматозоидов под световым микроскопом Axio Skop.A1 (Carl Zeiss, Германия) при ув. 1000. Размеры сперматозоида оценивали с помощью окулярного микрометра. У сперматозоида выделяли 3 морфологические части: головку, среднюю часть и хвост [1, 24]. К дефектам головки относили большую, маленькую, коническую, грушевидную, круглую, аморфную, вакуолизированную, двойную, аномальную акросому или ее отсутствие (и любую их комбинацию), к дефектам средней части - склоненную головку, асимметричное прикрепление головки, утолщённую, тонкую среднюю часть, наличие цитоплазматической капли (и любую их комбинацию). Дефектами хвоста считали короткий, изогнутый, закрученный, двойной (и любую их комбинацию). Длина головки в норме находилась в пределах 4,0-5,5 мкм, а ширина - 2,5-3,5 мкм, средняя часть - менее 1 мкм в ширину, хвост - 45 мкм в длину. По местоположению дефекта каждый сперматозоид был отнесен к одной из 7 групп: дефекты головки, средней части, хвоста, сочетанные дефекты головки и средней части, сочетанные дефекты средней части и хвоста, сочетанные дефекты головки и хвоста, сочетанные дефекты головки, средней части и хвоста (тройные). Определяли частоту встречаемости (%) сперматозоидов с каждым видом морфологического дефекта. Редко встречающиеся морфологические аномалии сперматозоидов, такие как большая, маленькая, двойная, иглоподобная головка или двойной хвост, рассматривали как минорные и не учитывали. Рассчитывали индекс тератозооспермии (TZI), который представляет собой отношение числа выявленных морфологических дефектов к числу дефектных сперматозоидов, и индекс дефектности сперматозоидов (SDI) - отношение числа морфологических аномалий к числу просчитанных сперматозоидов. Проводили однофакторный дисперсионный анализ полученных данных с использованием пакета компьютерных программ STATISTICA (версия 6.0). Для всех показателей определяли среднее значение и его стандартную ошибку. Проверку изучаемых параметров на нормальность распределения проводили по критерию Колмогорова-Смирнова. Все параметры, распределение которых не соответствовало нормальному, были подвергнуты преобразованию (десятичное логарифмирование, арксинус, возведение в квадрат). В рамках дисперсионного анализа для сравнения групп применяли тест Дункана. Для выявления взаимосвязи между показателями применяли корреляционный анализ по Пирсону. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез составлял Р<0,05. Результаты исследования. Согласно рекомендациям ВОЗ заключение о потенциальной фертильности мужчины делается преимущественно по трем показателям: концентрации сперматозоидов в эякуляте, их подвижности и морфологическим характеристикам. Нарушение сперматогенеза характеризуется снижением концентрации сперматозоидов в эякуляте (менее 15,0 млн/мл), доли подвижных сперматозоидов (менее 40%) и доли сперматозоидов с нормальными морфологическими характеристиками (менее 4,0%) (одного, попарно или сразу всех) (табл. 1). Мужчины славянской этнической принадлежности не отличались от мужчин других этнических групп по основным показателям сперматогенеза, и все группы были объединены. Ретроспективно, на основании концентрации, подвижности и морфологических характеристик сперматозоидов были сформированы 3 группы мужчин. Первая группа (48,7% от числа обследованных) характеризовалась нормальными показателями концентрации, подвижности и строения сперматозоидов (нормоспермия), т. е. удовлетворяла референтным значениям, предложенным ВОЗ для нормы. Во второй и третьей группах наблюдались разной степени нарушения сперматогенеза. Вторая группа (20,7% от числа обследованных) характеризовалась только сниженной подвижностью сперматозоидов (изолированная астенозооспермия) - третья (17,1% от числа обследованных) имела сочетанное снижение всех трех основных показателей сперматогенеза (концентрации, подвижности и морфологических характеристик) относительно референтных значений ВОЗ для нормы. Остальные 13 мужчин распределились на мелкие группы с попарным снижением концентрации, подвижности и морфологических изменений сперматозоидов. В группе со сниженной подвижностью сперматозоидов (астенозооспермия) наблюдалось уменьшение доли морфологически нормальных сперматозоидов, концентрации сперматозоидов и повышение индексов TZI и SDI по сравнению с нормой (P<0,05). В группе с сильным нарушением сперматогенеза (олигоастенотератозооспермия), когда снижены все основные параметры сперматогенеза - концентрация, подвижность и морфологические характеристики сперматозоидов, - наблюдалось значимое (P<0,01) по сравнению с нормой увеличение индексов TZI, SDI и уменьшение битестикулярного объема. Основной вклад в морфологические аномалии сперматозоидов делает аморфная головка, доля которой значимо не различается у обследованных с нормальным и ослабленным сперматогенезом (табл. 2). Группа мужчин со сниженной подвижностью сперматозоидов характеризовалась значимо повышенной частотой встречаемости сперматозоидов с аномалиями акросомы (P<0,01), незначимым повышением доли сперматозоидов со склоненной головкой и утолщенной средней частью, что выразилось в значимом увеличении сочетанных аномалий головки и средней части (P<0,01) по сравнению с нормой. Более широкий диапазон морфологических дефектов наблюдался в группе обследованных с олигоастенотератозооспермией. В этой группе была значимо выше, чем в норме, частота встречаемости сперматозоидов с аномальной акросомой с вакуолизированными и склоненными головками, утолщением средней части, наличием цитоплазматической капли, закрученного или короткого хвоста (P<0,01). Эта группа отличалась от группы с астенозооспермией более высокой долей дефектов акросомы, склоненных и вакуолизированных головок, цитоплазматических капель, утолщенной средней части, закрученных и коротких хвостов (P<0,05), что сопровождалось значимым увеличением доли сочетанных аномалий головки и хвоста, а также тройных аномалий (P<0,05). Корреляционный анализ показателей сперматогенеза у всех обследованных позволил установить значимую (Р<0,01) положительную взаимосвязь между концентрацией и долей подвижных сперматозоидов и сперматозоидов с нормальными морфологическими характеристиками (табл. 3). Была обнаружена значимая (P<0,01) отрицательная взаимосвязь между концентрацией, долей подвижных сперматозоидов и сперматозоидов с нормальными морфологическими характеристиками TZI и SDI (см. табл. 3). Корреляционный анализ показателей сперматогенеза в группе обследованных с нормальными характеристиками сперматогенеза продемонстрировал значимую положительную взаимосвязь между концентрацией, долей подвижных сперматозоидов и сперматозоидов с нормальными морфологическими характеристиками, однако абсолютные значения коэффициентов корреляции были ниже (Р<0,01), чем у всех мужчин (см. табл. 3). В этой группе наблюдалась значимая (Р<0,01) отрицательная взаимосвязь между долей подвижных и морфологически нормальных сперматозоидов и TZI и SDI с более низкими абсолютными значениями коэффициентов корреляции, чем у обследованных (см. табл. 3). В группе мужчин с пониженной подвижностью сперматозоидов (астенозооспермия) доля подвижных сперматозоидов была положительно взаимосвязана с их концентрацией (P<0,01), но не коррелировала с долей морфологически нормальных сперматозоидов (табл. 4). Доля морфологически нормальных сперматозоидов была значимо (P<0,01) отрицательно связана с SDI. В группе мужчин с сочетанным снижением концентрации, подвижности и морфологических характеристик сперматозоидов (олигоастенотератозооспермия) только доля подвижных сперматозоидов и концентрация были положительно взаимосвязаны (P<0,01), но они не коррелировали с долей морфологически нормальных сперматозоидов (см. табл. 4). Доля морфологически нормальных сперматозоидов была значимо отрицательно связана с TZI и SDI (P<0,01). Статистический анализ взаимосвязи между долей подвижных сперматозоидов и частотой встречаемости различных морфологических дефектов сперматозоидов у всех обследованных мужчин позволил установить следующие значимые отрицательные коэффициенты корреляции между долей подвижных сперматозоидов и частотой встречаемости: 1) дефектов акросомы (r = - 0,55, P<0,01); 2) вакуолизированных и склоненных головок (r = -0,24, r = -0,50 соответственно, P<0,01); 3) цитоплазматических капель и утолщения средней части сперматозоида (r = - 0,26, r = - 0,33 соответственно, P<0,01); 4) закрученного и короткого хвоста (r = -0,30, r = -0,58 соответственно, P<0,01). В группе обследованных с нормальными показателями сперматогенеза (нормоспермия) выявлена значимая отрицательная связь между долей подвижных сперматозоидов и частотой встречаемости аномалий акросомы (r = -0,30, P<0,01). В группе мужчин с пониженной подвижностью сперматозоидов (астенозооспермия) значимой корреляции доли подвижных сперматозоидов и частотой встречаемости различных типов морфологических дефектов не установлено. В группе мужчин с пониженными концентрацией, подвижностью и морфологическими характеристиками сперматозоидов (олигоастенотератозооспермия) значимые отрицательные коэффициенты корреляции выявлены между долей подвижных сперматозоидов и частотой встречаемости склоненных головок (r = -0,62, P<0,01), закрученных и коротких хвостов (r = -0,56, r = -0,66 соответственно, P<0,01). Обсуждение полученных данных. В настоящее время оценка морфологических параметров сперматозоидов признана в качестве клинико-диагностического инструмента потенциальной мужской фертильности. Анализ строения сперматозоидов по «строгим критериям» нормы может служить надежным индикатором функциональной активности сперматозоидов [4, 7, 8]. Основные показатели сперматогенеза - концентрация, подвижность и морфологические характеристики сперматозоидов - тесно взаимосвязаны [3, 7, 18, 21], что подтверждается и проведенным нами исследованием: у всех мужчин с нормальными показателями сперматогенеза наблюдалась взаимосвязь между концентрацией, долей морфологически нормальных и прогрессивно подвижных сперматозоидов, однако у мужчин с ослабленным сперматогенезом эти связи были не обнаружены. Эти факты свидетельствуют о том, что морфологическая характеристика сперматозоидов является независимым показателем сперматогенеза, который весьма чувствителен к изменению условий среды. В нашей работе доля морфологически нормальных сперматозоидов у всех обследованных сибирских мужчин совпадала с данными, полученными у доноров сперматозоидов в Кливленде (США) с применением «строгих критериев» анализа морфологических характеристик [5]. Эти же авторы установили, что увеличение морфологических аномалий сперматозоидов сопровождается избыточной продукцией активных радикалов кислорода, что повреждает сперматозоиды и может приводить к бесплодию. Другими исследователями [14], которые также использовали «строгие критерии» для анализа морфологических характеристик сперматозоидов у мужчин, проживающих в Норвегии и Дании, получены данные, близкие к результатам настоящей работы. Однако в Финляндии и Эстонии эти же исследователи обнаружили более высокую долю морфологически нормальных сперматозоидов, что они объяснили генетическими различиями, действием разных факторов среды или их комбинацией. В настоящей работе у обследованных молодых мужчин среди морфологических аномалий сперматозоидов преобладали аморфная головка, аномалии (или отсутствие) акросомы и в меньшей степени - средней и хвостовой части сперматозоида, причем с высокой долей сочетанных аномалий головки и средней части. Спектр и частота встречаемости морфологических дефектов сперматозоидов у молодых мужчин в настоящем исследовании (г. Кемерово) аналогичны полученным ранее данным при обследовании мужчин г. Новосибирска [3]. Нами были выделены группы мужчин с нормальным и ослабленным сперматогенезом и установлены существенные различия между ними. В группе мужчин с астенозооспермией доля нормальных сперматозоидов не была ниже референтных значений, принятых для нормы, но доля морфологических аномалий акросомы была увеличенной. В то же время в этой группе не установлено связи между долей подвижных сперматозоидов и частотой встречаемости различных типов их морфологических дефектов, включая акросому. Учитывая, что формирование акросомы проходит в процессе спермиогенеза, а приобретение сперматозоидами подвижности и способности осуществлять акросомную реакцию формируется в придатках яичек [1], снижение подвижности и неправильное развитие акросомы может отражать нарушение функции как тех, так и других при действии многих факторов, включая урогенитальные инфекции и индивидуальный образ жизни [6, 7]. Часто после лечения антибиотиками и антиоксидантами, нормализации индивидуального образа жизни морфологические характеристики сперматозоидов и их подвижность восстанавливаются [7]. Вторая группа мужчин с ослабленным сперматогенезом (олигоастенотератозооспермия) характеризовалась высоким уровнем дефектности сперматозоидов, включая увеличение доли вакуолизированной и склоненной головки, аномалий акросомы, цитоплазматических капель, утолщения средней части и аномалий хвоста, что сопровождалось увеличением доли сочетанных аномалий. Повышение доли дефектных сперматозоидов может являться сигналом развивающихся репродуктивных нарушений, поскольку повышенная доля сперматозоидов с множественными морфологическими дефектами отражает глубокие нарушения в функционировании яичек. Об этом свидетельствуют результаты электронномикроскопического изучения сперматозоидов у мужчин с астенотератозооспермией [22]. Авторы обнаружили нарушение формирования средней части сперматозоидов и сопряженность сниженной подвижности сперматозоидов с повышением фрагментации ДНК. В настоящее время принята точка зрения, что одним из основных патогенетических механизмов, повреждающих сперматозоиды и вызывающих тератозооспермию, является избыток реактивных радикалов кислорода [4, 5, 15]. Уменьшение антиоксидантной активности семенной плазмы, в частности каталазы и 8-изопростана, может играть ключевую роль и служить биомаркером ослабленного сперматогенеза, включая астенозооспермию и олигоастенотератозооспермию [5, 15]. Выяснение влияния индивидуального образа жизни (курение, алкоголь, психологический стресс, ожирение) и эколого-климатических факторов (загрязнение окружающей среды) на морфологические характеристики сперматозоидов позволило бы идентифицировать морфологические маркеры, чувствительные к повреждающим агентам. Исследования такого рода требуют значительных по своей величине выборок, что обусловлено большим количеством факторов, их взаимодействием и сравнительно небольшой степенью влияния на сперматогенез каждого из них [6, 7, 13]. Итак, в настоящей работе установлено, что у молодых мужчин из общей популяции, проживающих в Западной Сибири, доля сперматозоидов с нормальными морфологическими характеристиками совпадает с аналогичными показателями у мужчин из популяций США и скандинавских стран. Среди патологически измененных сперматозоидов преобладали аморфная головка, аномалии акросомы, сочетанные дефекты головки и средней части сперматозоида. Морфологическим маркером ослабленного сперматогенеза может служить повышенная частота морфологических аномалий акросомы. Полученные данные могут быть использованы при сравнительном анализе сперматогенеза в популяционном аспекте.

About the authors

L. V. Osadchuk

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics

Email: losadch@bionet.nsc.ru

M. A. Kleshchev

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics

Email: max82cll@bionet.nsc.ru

N. N. Kuznetsova

«Ergin» Medical Center

Email: erginmc@gmail.com

A. V. Osadchuk

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics

Email: osadchuk@bionet.nsc.ru

References

Supplementary files