STRUCTURE OF THE TESTES IN RATS DEVELOPING UNDER CONDITIONS OF MATERNAL CHOLESTASIS, PECULIARITIES OF THEIR REPRODUCTIVE CHARACTERISTICS AND OFFSPRING DEVELOPMENT

Abstract

The study of outbred albino rats, in mothers of which an extrahepatic obstructive cholestasis was modeled on the 17th day of pregnancy, demonstrated the changes in ther testes that were identified even in animals reaching sexual maturity. Marked swelling of the interstitium, reduced numbers of interstitial cells, the delay of convolution of the seminiferous tubules were detected. The latter had reduced thickness of the seminiferous epithelium layer due to the reduction in the number of spermatogenic cells with the development of destructive changes that adversely affected the process of spermatogenesis. Fertilizing capacity of these males was reduced to 42.9%, the duration of their offspring development was increased, the number of pups per litter was reduced (with the presence of stillborn among them). During the early postnatal period, there was a delay in their weight gain and physical development.

Full Text

В структуре неблагоприятных социальных, экологических, медико-биологических и других факторов [6] особое место занимают заболевания гепатобилиарной системы, нередко у беременных сопровождаемые холестазом, что приводит у родившегося в этих условиях потомства к отставанию в физическом развитии, снижению резистентности и нарушению органогенеза [5, 8, 9]. Не являются исключением при этом и органы половой системы. Согласно современным представлениям репродуктологии, мужскому фактору в структуре бесплодия уделяется большое внимание [1]. Экспериментально установлено, что хронические поражения печени самок крыс приводят у потомства к неспецифическим морфологическим изменениям семенников - уменьшению их массы, диаметра извитых семенных канальцев, индекса сперматогенеза, увеличению объема интерстициальной ткани, а в ней числа интерстициальных клеток [11]. Аналогичные данные получены при экспериментально моделируемом на 17-е сутки беременности у белых крыс подпечёночном обтурационном холестазе [7, 8]. Установлено, что в ранние сроки постнатального периода при этой патологии имеет место уменьшение в извитых семенных канальцах числа сперматогоний, а в более поздние - сперматоцитов и сперматид, сопровождающееся развитием в них деструктивных изменений, оказывающих отрицательный эффект при формировании спермиев. При этом указанные изменения с возрастом не нивелируются [7]. Как влияют данные изменения структуры семенников на репродуктивную способность таких самцов и на развитие полученного от них потомства неизвестно. Поэтому цель данного исследования - изучить оплодотворяющую способность самцов 1-го поколения, родившихся в условиях холестаза матери, и особенности у родившегося от них потомства 2-го поколения. Материал и методы . Эксперимент проведен на 2 группах половозрелых самок (n=7) и самцов беспородных белых крыс и родившемся от них потомстве 1-го и 2-го поколения с применением соматометрического, гистологического, морфометрического и статистического методов исследования. Все исследования были выполнены с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» [2]. Опытную группу составили 14 самцов 1-го поколения массой 330-350 г, рожденных от самок с моделированным на 17-е сутки беременности подпечёночным обтурационным холестазом [4]. Для получения потомства 2-го поколения этих самцов спаривали с 14 интактными самками массой 200-230 г. В контрольную группу входили 6 самцов и 6 самок аналогичной массы. В вечернее время самцов 1-го поколения подопытной и контрольной групп подсаживали к обычным самкам попарно в отдельные клетки со свободным доступом к воде и пище. День обнаружения во влагалищных мазках самок сперматозоидов (в утренние часы) считали первым днем беременности, и такие пары животных в последующих подсадках не участвовали. Если же у самок во влагалищных мазках спермии не обнаруживались, то этих самцов продолжали подсаживать к самкам еще в течение 3 нед, что давало возможность убедиться в их стерильности. Самцов подопытной и контрольной групп по завершении эксперимента умерщвляли передозировкой парой эфира и брали семенники. Крыс и семенники взвешивали. Кусочки семенников фиксировали в жидкости Карнуа и заливали в парафин по принципу «контроль-опыт». Изготовленные на микротоме Leica RM 2125 (Leica, Германия) парафиновые срезы толщиной 5 мкм после окрашивания гематоксилином - эозином использовали для гистологических, морфометрических исследований и получения иллюстрационного материала. Морфометрически исследованы структуры сперматогенного пласта при различных увеличениях микроскопа Axioscop 2 plus (Zeiss, Германия), цифровой видеокамеры (LeicaDFC 320, Германия) и программы анализа изображения Image Warp (Bitflow, США). Самок, забеременевших от самцов 1-го поколения подопытной и контрольной групп, содержали в отдельных клетках в стандартных условиях вивария под тщательным наблюдением. На 1-, 10-, 17-еи 21-е сутки беременности определяли массу этих самок, фиксировали длительность беременности и даты родов с подсчетом числа крысят 2-го поколения в помете. Отмечали наличие в помете мертворожденных и внешние аномалии у родившихся крысят. Определяли массу полученного потомства на 1-, 5-, 10-, 15-, 45-еи 90-е сутки после рождения. В ранний постнатальный период изучали и физическое развитие крысят по общепринятым показателям: отлипание ушных раковин, появление шерстного покрова, прорезывание резцов и открытие глаз. Крысят по достижении 15-, 45-и 90-суточного возраста умерщвляли передозировкой паров эфира, брали различные органы, определяли их абсолютную массу и весовые индексы. Полученный цифровой материал подвергали параметрической статистике с использованием лицензионной программы «Statistica 6,0» для Windows. Различия между группами считали статистически значимыми, если вероятность ошибочной оценки не превышала 5% (P<0,05). Результаты исследования. В контрольной группе в процессе двух подсадок самцов 1-го поколения к самкам наступала 100% оплодотворяемость, а в подопытной группе при 3 подсадках - у 6 самок из 14, что составило 42,9%. Восемь самцов подопытной группы, которые не смогли оплодотворить самок, продолжали подсаживать к самкам еще в течение 3 нед, но безрезультатно, что свидетельствует об их стерильности. Необходимо отметить, что подопытные самцы взяты из потомства 1-го поколения, развивавшегося в условиях холестаза матери. Несмотря на то, что число крысят 1-го поколения в помете на 1 рожавшую самку в подопытной группе составило 9,15±0,3 крысенка (64 крысенка от 7 самок) при 8,28±0,20 в контроле (P<0,05), уже при рождении они проявляли признаки физиологической незрелости - были менее подвижными, меньшей массы, отличались более низким ее приростом, имели синюшный оттенок кожи и слабо сосали мать (табл. ). Индекс массы их семенников на 15-е сутки после рождения составил 84,8% от такового в контроле, а по достижении 90-суточного возраста был на 3,9% выше. Тем не менее в семенниках наблюдались структурные изменения (табл. ). В семенниках подопытных самцов 1-го поколения, развивавшихся в условиях эндогенной интоксикации при холестазе матери, даже в период их половозрелости имела место отечность межканальцевой стромы, снижение в ней числа интерстициальных клеток. Они отличались полиморфизмом и разной по степени выраженности оксифилией, но располагались, как и в контроле, в непосредственной близости от перитубулярных кровеносных капилляров. Однако количество этих капилляров вокруг семенных канальцев было снижено, уменьшен и их диаметр. Несмотря на половозрелость самцов, многие их извитые семенные канальцы отличались прямолинейным ходом, что свидетельствует о задержке их спирализации. Численная плотность семенных канальцев на единице площади среза органа из-за отечности интерстиция была снижена. Значительно сужен и их диаметр, уменьшены толщина эпителия сперматогенного пласта и число слоев, входящих в его состав сперматогенных клеток. В ранние сроки после рождения (15-е сутки) это происходит за счет сперматогоний, а в период половозрелости - за счет сперматоцитов и сперматид с развитием в последних деструктивных изменений в виде микровакуолизации цито- и даже нуклеоплазмы. Процесс формирования спермиев встречался редко даже в тех канальцах, которые сохранили диаметр, толщину сперматогенного пласта и послойное расположение в нем сперматогенных клеток. В большом количестве в семенниках наблюдались канальцы, полностью лишенные сперматогенных клеток (рисунок, а). В таких канальцах сохранялись поддерживающие эпителиоциты, однако проявлялась тенденция к уменьшению их количества и размеров ядер. Кроме того, эти клетки подвергались значительной микро- и макровакуолизации цитоплазмы, а иногда и нуклеоплазмы (см. рисунок, б). Между сперматогенными клетками в извитых семенных канальцах часто встречались расширенные межклеточные пространства, что способствовало десквамации сперматогенных клеток и скоплению их в просвете канальцев, где они подвергались деструктивным, а иногда и некротическим изменениям. Поскольку не все из подопытных самцов 1-го поколения, развивавшихся в условиях холестаза матери, теряли способность к оплодотворению, был проведен сравнительный внутригрупповой гистологический и морфометрический анализ структур извитых семенных канальцев их семенников. Обнаружено, что изменения в общей структуре извитых семенных канальцев семенников крыс группы «холестаз», потерявших способность к оплодотворению, значительнее выражены, чем у самцов этой же группы, её сохранивших (табл. 3). Однако прирост массы крыс, забеременевших от подопытных самцов 1-го поколения, существенно не отличался от такового в контрольной группе - на 10-е сутки беременности он был незначительно выше (10,8% при 8,0% в контроле), но уже на 17-е и, тем более, на 22-е сутки этот показатель отставал на 15 и 1% в опыте при 19 и 9% в контроле соответственно. Что касается длительности беременности, то число самок в подопытной группе, родивших на 21-е и 22-е сутки, было равным, а в контрольной число рожавших на 21-е сутки составило 66%, а на 22-е - 34%. Эти данные свидетельствуют о том, что длительность вынашивания плодов в подопытной группе имеет тенденцию к увеличению. Общее количество родившихся в данной группе крысят 2-го поколения от 6 самок было 55, из них - 6 мертворожденных. Показатель рождаемости в подопытной группе - 9,1±0,4 крысят на одну рожавшую самку, а в целом на 14 самок в группе - 3,9. При этом в помете наблюдался значительный разброс количества крысят - от 2 до 11. В контрольной группе от 6 самок родились 67 крысят, показатель рождаемости составил 11,2±0,2 крысенка на одну рожавшую самку (P<0,05). Мертворожденных крысят в этой группе не было. Необходимо отметить, что родившиеся в подопытной группе крысята 2-го поколения на 1-е и 5-е сутки после рождения отличались незначительно меньшей массой (5,5±0,4 г и 6,5±0,5 г при 6,6±0,5 г и 11,60±0,06 г в контроле, P>0,05), были менее активными и имели синюшный оттенок кожного покрова. На 10-е и 15-е сутки показатели массы крысят в подопытной и контрольной группах выравнивались, а на 45-е сутки даже превышали таковую в контрольной группе. В ранние сроки постнатального онтогенеза эти крысята отставали в приросте абсолютной массы тела и органов - особенно в физическом развитии (табл. , 5). Подопытные крысята 2-го поколения на 15-е сутки после рождения, как и животные 1-го поколения, развивавшиеся в условиях холестаза матери, в отличие от таковых в контрольной группе, отставали не только в приросте массы тела и их органов, но и в физическом развитии. На 45-е и, тем более, 90-е сутки постнатального онтогенеза при переходе с молочного на дефинитивный тип питания показатели массы тела достигали контрольного уровня. Контрольных значений достигали и весовые индексы изученных органов. Обсуждение полученных данных. Анализ полученных результатов исследования дает возможность констатировать факт отрицательного воздействия развивающейся эндогенной интоксикации при холестазе матери на становление в постнатальный период, вплоть до половозрелости, структурных компонентов семенников крысят 1-го поколения. В них развивается отечность межканальцевой соединительной ткани, уменьшается количество интерстициальных эндокриноцитов, задерживается спирализация семенных канальцев с уменьшением толщины сперматогенного пласта, вплоть до исчезновения в некоторых участках сперматогенных клеток и развитием в последних, как и в поддерживающих эпителиоцитах, деструктивных изменений. Все это оказывает негативное воздействие на процесс сперматогенеза. Оплодотворяющая способность таких самцов снижена, и многие из них становятся стерильными. При наступавшей от таких самцов беременности наблюдалась тенденция к удлинению срока вынашивания плодов, уменьшению числа новорожденных в помете крысят на рожавшую подопытную крысу, наличие среди них мертворожденных. Родившееся от этих самцов потомство 2-го поколения отличалось синюшным цветом кожного покрова, отставанием в ранние сроки постнатального периода в физическом развитии, меньшей массой тела, снижением ее прироста и весовых индексов печени, поджелудочной железы, почек, надпочечников и половых желез. Восстановление параметров массы тела подопытных животных и многих изученных органов наблюдалось в основном к 45-м суткам после рождения. Немаловажную роль в этом, вероятно, играет переход с молочного питания на дефинитивное. В целом потомство 2-го поколения по направленности изменений изучаемых признаков ничем не отличалось от 1-го поколения животных, развивавшихся непосредственно в условиях холестаза матери [8]. Однако по многим показателям выраженность этих изменений была менее наглядна и зачастую статистически недостоверна. Последнее, по нашему мнению, свидетельствует о том, что наблюдающиеся изменения в развитии потомства 2-го поколения крысят запрограммированы в геноме спермиев 1-го поколения под воздействием холестатической интоксикации компонентами желчи, особенно желчными кислотами, содержание которых резко возрастает в крови при холестазе как у беременных (в 10-100 раз), так и у животных при экспериментальном обтурационном холестазе [4, 12]. Аналогичного мнения придерживаются и другие исследователи, добавляя при этом, что холестаз может программировать структурные изменения в органах потомства путем нарушения обмена веществ [13].