STRUCTURAL AND HISTOCHEMICAL CHANGES IN NEURONS OF RAT FRONTAL CEREBRAL CORTEX IN CHOLESTASIS

Full Text

Желчнокаменная болезнь широко распространена в современном обществе [12]. При этой патологии часто происходит нарушение оттока желчи, приводящее к её застою в желчевыводящих путях (холестазу), прекращению её поступления в двенадцатиперстную кишку и накоплению компонентов желчи в крови [1]; происходит нарушение пищеварения и всасывания пищи в кишечнике (особенно жиров), уменьшается масса тела и усвоение жирорастворимых витаминов А, D, Е, К, а также кальция. В органах нарушаются процессы перекисного окисления липидов, изменяется текучесть мембран и активность Na+/ K+-АТФазы [7]. В условиях холестаза отмечаются функциональные и структурные изменения во многих органах и системах организма, включая центральную нервную систему. При этом ослабевает аналитико-синтетическая деятельность коры головного мозга, нарушаются процессы коркового возбуждения и торможения, развиваются неврастения, энцефалопатия и энцефаломиелопатия, наблюдаются симптомы диффузного поражения головного мозга [6, 13]. Эти процессы связывают с повышением содержания билирубина и желчных кислот в крови, приводящего к поражению гематоэнцефалического барьера, и проникновением этих соединений в ткани мозга [8]. В литературе описаны лишь единичные гистологические исследования головного мозга при холестазе. Так, в ЦНС у людей, погибших от механической желтухи, установлены диффузные токсико-гипоксические изменения нейронов и нейроглии, а также сосудов мозга. При этом в нейронах мозга отмечены набухание, локальный и тотальный хроматолиз в сочетании с гиперхромией, перинуклеарная гидропическая дистрофия [4]. Начиная с 5-х суток после перевязки общего желчного протока (ОЖП) у крыс наблюдали отек мозга в периваскулярной и перицеллюлярной областях, увеличение количества клеток микроглии практически во всех участках головного мозга [11]. Другие авторы на 15-е сутки после перевязки ОЖП у мышей наблюдали сильный отек мозга, связанный с нарушением проницаемости стенки кровеносных сосудов [10]. При экспериментальном холестазе в телах нейронов головного мозга собак были обнаружены простая атрофия нервных клеток, пикноз их ядер и ячеистая структура цитоплазмы [9]. В наших предыдущих исследованиях установлено, что у крыс в течение 20 сут после перевязки ОЖП происходит прогрессивное нарастание структурных и цитохимических нарушений в клетках Пуркинье мозжечка, приводящее к тяжёлым и необратимым изменениям нейронов, вплоть до их гибели. Наблюдаются гиперхромные, сморщенные нейроны, в нервных клетках выявляется деструкция органелл, особенно митохондрий, увеличиваются число и размеры лизосом. В отдалённые сроки после операции (45-90-е сутки) у выживших животных происходит постепенная нормализации структуры и метаболизма клеток Пуркинье мозжечка [2]. Сходные изменения при холестазе были обнаружены нами ранее и в гистаминергических нейронах гипоталамуса крыс [3]. Цель настоящего исследования - изучить структурные и гистохимические изменения в нейронах фронтальной коры головного мозга крыс в динамике подпеченочного холестаза. Материал и методы. В работе использован материал от 72 беспородных белых крыс-самцов массой 200±25 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария. На проведение исследований получено разрешение этического комитета Гродненского государственного медицинского университета (протокол № 3 от 08.11.2016 г.). Перевязку ОЖП на 3-5 мм ниже слияния долевых протоков проводили двумя лигатурами с последующим пересечением между ними. Животным контрольной группы проводили ложную операцию. Через 2, 5, 10, 20, 45 и 90 сут в утренние часы (для синхронизации по времени), предварительно усыпив парами эфира, животных выводили из эксперимента с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» в соответствии с Хельсинкской декларацией 1975 г. и ее пересмотренным вариантом 2000 г. Быстро извлекали головной мозг, кусочек лобной доли (в области 4,20-1,80 мм от брегмы согласно стереотаксическому атласу мозга крысы [14]) правого полушария размером 5-7 мм фиксировали в жидкости Карнуа (для гистологического исследования). Кусочек лобной доли левого полушария такого же размера замораживали и хранили в жидком азоте (для дальнейшего гистоэнзиматического исследования). Фронтальные парафиновые срезы коры толщиной 7 мкм изготавливали на микротоме LeicaRM 2125 RTS (Leica, Германия). Выявление микроструктурных компонентов ткани мозга производили гематоксилином - эозином, тионином по методу Ниссля. Погибшие нейроны выявляли методикой Викторова [16], гистохимический анализ содержания РНК проводили по Эйнарсону [5]. Фронтальные криостатные срезы коры толщиной 10 мкм выполняли на криостате Leica CM 1840 (Leica, Германия). Срезы обрабатывали общепринятыми гистохимическими методиками для выявления активности ферментов: связанных с циклом Кребса - сукцинатдегидрогеназы (СДГ; КФ 1.3.99.1); с пентозофосфатным путем - дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата (Г-6-ФДГ; КФ 1.1.1.49); с транспортом электронов - дегидрогеназы восстановленного НАД (НАДН-ДГ; КФ 1.6.99.3); с гликолизом - лактатдегидрогеназы (ЛДГ; КФ 1.1.1.27). Для выявления кислой фосфатазы, являющейся маркерным ферментом лизосом (КФ; КФ 3.1.3.2), срезы предварительно фиксировали в 10% нейтральном формалине и обрабатывали по методу Gomori [5]. Визуальную оценку, микрофотографирование и морфометрию гистологических и гистохимических препаратов проводили при помощи светового микроскопа «Axioscop 2 plus» с цифровой видеокамерой «Axio Cam MR c5» (Карл Цейс, Германия) и программы анализа изображения Image Warp (Bit Flow, США). На препаратах, окрашенных по Нисслю, используя метод случайной выборки 10 полей зрения на площади в 1 мм2, подсчитывали общее число нейронов, среди них: нормохромных, гипохромных, гиперхромных не сморщенных, гиперхромных сморщенных, клеток-теней, а также число клеток глии. Оценку размеров и формы тел нейронов на препаратах, окрашенных по Нисслю, проводили путем измерения их минимального и максимального диаметров, периметра, площади, объема, форм-фактора и фактора элонгации. В каждой экспериментальной группе оценивали 120-200 нейронов. Количественную оценку активности изучаемых ферментов проводили цитофотометрически на максимуме поглощения окрашенного продукта реакции. В каждой экспериментальной группе оценивали 150-200 нейронов (по 20-30 нейронов у каждого животного). Для выяснения причины восстановления структурно-метаболического состояния коры мозга у крыс в отдалённые сроки после перерезки ОЖП через 10, 20 и 90 сут после операции в его культю (выше места перерезки) вводили тушь с желатиной и оценивали развитие новообразованных обходных желчевыводящих протоков. Полученные цифровые данные обрабатывали методами непараметрической статистики с помощью лицензионной компьютерной программы Statistica 10 для Windows. Достоверными считали различия между контрольной и опытной группами при значениях р<0,05 (Mann-Whitney U-test). Результаты исследования. После перевязки ОЖП наблюдается постепенное нарастание структурных и гистохимических изменений в нейронах фронтальной коры мозга крыс. Они появляются на 2-5-е сутки холестаза и достигают максимума на 10-20-е сутки. Во многих нейронах ядра деформированы, ядрышки расположены эксцентрично. В цитоплазме определяется частичный лизис хроматофильного вещества, но в некоторых нейронах выявляется гиперхроматоз. При этом во всех слоях коры определяются сморщенные нейроны. Они выглядят вытянутыми, темными, гиперхромными. Иногда апикальные дендриты пирамидных нейронов приобретают штопорообразный вид (рис. 1, а, б). В некоторых нейронах выявляется вакуолизация цитоплазмы. Кроме того, определяются клетки-тени с гипохромной цитоплазмой и светлым, пузырьковидным ядром, наблюдается сателлитоз (см. рис. 1, в). При специальной окраске по Викторову во всех слоях фронтальной коры выявляются фуксинофильные гибнущие нейроны. Через 10 сут холестаза в слое III фронтальной коры число нормохромных нейронов уменьшается на 32,3%. При этом увеличивается количество гипохромных - в 2,9 раза, гиперхромных не сморщенных - в 2,1 раза, гиперхромных сморщенных - в 6,1 раза и клеток-теней - в 10,6 раза по сравнению с контрольной группой. Число погибших нейронов, определяемых по методу Викторова, возрастает в 5,4 раза (табл. 1). Аналогичные изменения отмечены в слое II и V коры. К 90-м суткам число поврежденных нейронов возвращается к контрольным значениям, за исключением уменьшения общего числа нормохромных нейронов, а также повышенного количества клеток глии. В динамике подпеченочного холестаза происходит изменение размеров и формы тел нейронов: во всех слоях коры они уменьшаются и становятся более вытянутыми. Наибольшие изменения определены на 10-20-е сутки (табл. 2). На 45-е и 90-е сутки форма и размеры тел нейронов постепенно нормализуются. Перевязка ОЖП приводит к постепенному снижению активности ферментов в цитоплазме нейронов: СДГ, НАДН-ДГ (рис. 2), Г-6-ФДГ и содержания РНК, при одновременном возрастании активности ЛДГ и КФ. Эти изменения максимальны на 10-20-е сутки. В дальнейшем во всех слоях фронтальной коры происходит частичная нормализация этих гистохимических показателей нейронов (45 сут), и к концу эксперимента (90 сут) они не отличаются от контроля (рис. 3). После введения туши с желатиной в культю ОЖП на 10-е сутки после операции у выживших животных выявляются единичные тонкие новообразованные желчевыводящие протоки, идущие в обход рубца на месте перерезки ОЖП. Они впадают в двенадцатиперстную кишку, которая заполняется тушью. На 20-е сутки эти протоки становятся крупнее, а на 90-е сутки у всех выживших животных размер новообразованного протока приближается к размеру нормального ОЖП. У животных, погибших от холестаза, такие обходные желчевыводящие протоки не выявляются. Обсуждение полученных данных. Полученные данные свидетельствуют о том, что холестаз сопровождается нарушением энергетического метаболизма в нейронах фронтальной коры мозга. Наблюдается угнетение системы транспорта электронов (НАДН-ДГ), пентозофосфатного пути (Г-6-ФДГ), функционирования митохондрий (СДГ) и биосинтеза белка (РНК). При этом компенсаторная активация гликолиза (ЛДГ), возможно, хотя бы частично компенсирует последствия нарушения энергетического обеспечения нейронов при холестазе. Выявленное повышение активности маркерного фермента лизосом КФ свидетельствует об активации лизосомального аппарата нейронов, что необходимо для усиления автофагии с целью своевременного удаления из клеток повреждённых мембран и органелл. Эти нарушения метаболизма в нейронах достигают максимума на 10-20-е сутки, а на 45-е и 90-е сутки постепенно нормализуются. В эти же сроки нарастают, а затем постепенно исчезают и гистологические нарушения в изучаемых нейронах. Установленная динамика гистологических и гистохимических изменений в нейронах фронтальной коры головного мозга крыс после перевязки ОЖП, вероятно, обусловлена холестазом, сопровождаемым нарастанием в крови таких токсических компонентов желчи, как билирубин и определённые жёлчные кислоты. Их содержание в крови достигает максимума на 10-20-е сутки после операции, что приводит к гибели более 50% крыс [1]. Нормализация выявленных морфофункциональных нарушений через 45 и 90 сут после операции у выживших животных может быть обусловлена своевременным образованием обходных желчевыводящих путей, обеспечивающих отток желчи в двенадцатиперстную кишку. При этом явления холестаза, включая желтуху и повышенный уровень в крови билирубина, холестерина и жёлчных кислот, исчезают, и гибели таких животных в поздние сроки после операции уже не происходит [1]. Можно полагать, что после перевязки ОЖП к 20-м суткам выживают только те животные, у которых успели прорасти обходные желчевыводящие протоки. Остальные погибают в результате полиорганной недостаточности, вызванной нарастающим холестазом. Следует отметить, что при холестазе у людей образование обходных желчевыводящих путей в достаточной мере не происходит, и без своевременной операции все они погибают [1]. Вопрос о непосредственных причинах поражения нейронов коры головного мозга при холестазе остаётся открытым. По-видимому, главным токсическим агентом при этом является билирубин, который проникает через гематоэнцефалический барьер [8]. Показано, что гипербилирубинемия, наблюдаемая при холестазе, вызывает разрушение цитоскелета, что, возможно, лежит в основе наблюдаемых изменений формы тел нейронов. Сморщивание нейронов может быть обусловлено и нарушением осмолярности их цитоплазмы и водно-солевого обмена [15]. При холестазе происходит деполимеризация микрофиламентов, что приводит к освобождению глутамата, к перевозбуждению и, в конечном итоге, к гибели нейронов [8, 15]. Подобные участки с патологически измененными и погибшими нейронами мы наблюдали при холестазе во фронтальной коре мозга. Таким образом, после перевязки ОЖП у крыс во фронтальной коре мозга развиваются глубокие структурные и гистохимические нарушения, которые появляются на 2-5-е сутки опыта и достигают максимального уровня на 10-20-е сутки. Они приводят к тяжёлым, необратимым нарушениям в некоторых нейронах (гиперхромные сморщенные нейроны, клетки-тени), гибели и уменьшению их числа. При этом в цитоплазме происходит нарушение энергетического и пластического метаболизма: угнетение дегидрогеназ сукцината, восстановленного НАДН, НАДФН и глюкозо-6-фосфата и уменьшение содержания РНК, но активация ЛДГ и КФ. Возможно, выявленные морфофункциональные нарушения нейронов фронтальной коры головного мозга являются одной из причин наблюдаемых неврологических и психических симптомов у больных с холестазом. У выживших животных, у которых к 20-м суткам после перевязки ОЖП образуются обходные желчевыводящие пути и холестаз исчезает, все изученные показатели в сохранившихся нейронах постепенно нормализуются. Выводы. 1. Перевязка общего желчного протока у крыс, сопровождающаяся холестазом, приводит к тяжёлым морфофункциональным изменениям в нейронах всех слоёв фронтальной коры мозга, которые появляются на 2-5-е сутки после операции и достигают максимума на 10-20-е сутки. При этом нарушаются размеры и форма, энергетический и пластический метаболизм нейронов, что приводит к гибели некоторых из них. В отдалённые сроки после перевязки общего желчного протока (45-90-е сутки) у выживших животных выявленные нарушения в нейронах постепенно нормализуются, хотя последствия холестаза проявляются очагами выпадения нейронов во всех слоях фронтальной коры и увеличением числа глиальных клеток. Причиной нормализации нарушений в нейронах коры мозга после такой операции у крыс могут быть устранение холестаза в результате разрастания обходных желчевыводящих путей и высокие адаптационные возможности нейронов. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: С. В. Е., С. М. З. Сбор и обработка материала: С. В. Е. Статистическая обработка данных: С. В. Е. Написание текста: С. В. Е., С. М. З. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

S. V. Yemelyanchik

Yanka Kupala Grodno State University

Email: semel@grsu.by
Department of Zoology and Human and Animals Physiology

S. M. Zimatkin

Grodno State Medical University

Email: smzimatkin@mail.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology

References

Supplementary files