CHARACTERIZATION OF CART PEPTIDEIMMUNOPOSITIVE CELLS OF THE SUBVENTRICULAR ZONE OF THE BRAIN

Full Text

Открытый в нейронах стриатума CART (cocaine-amphetamine-regulated transcript)-пептид изучали для выяснения его участия в патогенезе наркомании [1]. Однако он широко распространен в центральной, периферической и автономной нервной системе позвоночных и вовлечен в обеспечение разнообразных функций [2]. Большой интерес вызвало сообщение Y. Luo и соавт. [5] о влиянии этого пептида на регенераторные процессы в нервной ткани. Авторы с помощью комплекса методов показали, что неинвазивное интраназальное введение CART-пептида взрослым крысам, у которых экспериментально, путем окклюзии средней мозговой артерии был создан очаг инсульта, усиливало пролиферацию эндогенных нейрональных прогениторных клеток субвентрикулярной зоны боковых желудочков. CART-пептид также способствовал их миграции к очагу ишемического инсульта, следствием чего являлась реиннервация очага деструкции коры большого мозга. Между тем, способны ли нейрональные прогениторные клетки субвентрикулярной зоны в норме экспрессировать этот пептид, остается неизвестным. Выяснение этого вопроса явилось целью данного исследования. Материал и методы. Исследования субвентрикулярной зоны нижнего рога бокового желудочка, входящего в состав заднего отдела миндалевидного тела крысы, проведены на 18 белых половозрелых крысах-самках линии Вистар (головной мозг 3 крыс использован для изучения цитоархитектоники, 6 крыс - для выявления CART-пептида, 9 - для его обработки по методу Гольджи). Эвтаназию проводили с соблюдением правил гуманного обращения с экспериментальными животными, изложенных в Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS № 123) от 18 октября 2006 г. Цитоархитектонику исследуемой области изучали на фронтальных парафиновых срезах толщиной 20 мкм, окрашенных по методу Ниссля крезиловым фиолетовым. Иммуноцитохимическое выявление CART-пептида проводили на приготовленных в криостате (Leica, Германия) фронтальных срезах мозга толщиной 30 мкм после перфузии его 1 М фосфатным буфером (PBS, рН 7,4) и 4% раствором параформальдегида на 0,1 М PBS. После декапитации мозг был дополнительно фиксирован в том же фиксаторе в течение 4 ч при температуре 4 ºС, затем его промывали в нескольких порциях 0,9% NaCl на 0,02 M PBS (pH 7,4) и с целью криопротекции помещали в 30% раствор сахарозы на 0,02 М PBS при 4 ºС до полного погружения. До помещения срезов в 0,3% раствор перекиси водорода (для удаления эндогенной пероксидазы) они были промыты PBS и 0,1% Tween на 0,2 М PBS (Tween-20; Ferak, Германия). Затем в течение 1 ч срезы выдерживали в блокирующем растворе, который содержал 3% бычий сывороточный альбумин (BSA; Sigma, США) и 1% козий альбумин (GSA; Sigma, США), приготовленные на 0,1% Tween на 0,2 М PBS. После этого срезы инкубировали в растворе первичных поликлональных кроличьих антител к CART (55-102) (H-003-62, Phoeniх Pharm., Incorp, Belmont, CA, США), разведенном 1: 8000 на 1% BSA при 4 ºC в течение 48 ч. Далее срезы промывали при комнатной температуре в трех порциях PBS с Tween по 20 мин и в течение 2 ч инкубировали во вторичных антителах, конъюгированных с авединовым комплексом (ABC-kit 689321, ICN Biomedicals Inc., США). После промывания срезов в трех порциях PBS с Tween их помещали на 2 ч в пероксидазаантипероксидазный комплекс, конъюгированный со стрептовидином (ABC-kit 689321, ICN Biomedicals Inc., США). Затем срезы промывали в 3 порциях PBS по 15 мин и помещали на 10 мин в 0,05% раствор диаминобензидина (DAB, Sigma, США) с 0,015% перекисью водорода, разведенной на PBS. Вновь срезы промывали в нескольких порциях PBS, помещали на стекла SuperFrost/plus (MENZEL-GLAZER, Германия) и высушивали при комнатной температуре. После обработки в трех порциях 96о этанола и трех порциях ксилола срезы заключали под покровное стекло с помощью канадского бальзама. Для характеристики тел и отростков клеток субвентрикулярной зоны были использованы фронтальные срезы мозга толщиной 100 мкм, обработанные по методу Гольджи. Мозг после фиксации в жидкости Мюллера и дополнительной фиксации в смеси двухромовокислого калия и четырехокиси осмия выдерживали в 1% растворе нитрата серебра 10 сут в термостате, после чего обезвоживали в нескольких порциях этанола возрастающей концентрации и заливали в целлоидин. Микрофотографии готовили с помощью светового микроскопа Leica DMD 108 (Германия), имеющего оригинальную цифровую камеру и специализированное программное обеспечение для управления настройками микроскопа и захвата изображения с возможностью его сохранения на встроенной карте памяти 64 MB. Пользовались объективами 10 и 50. Полученные изображения экспортировали в компьютер СМ1740 компании ASUS и проводили визуальный анализ особенностей их строения. Результаты исследования. CARTпептид-иммунопозитивные клетки выявляются в субвентрикулярной зоне нижнего рога бокового желудочка, который расположен в заднем отделе миндалевидного тела (рисунок, а) в составе древней ее части - палеоамигдалы. В субвентрикулярной зоне (см. рисунок, б) преобладают клетки малого размера. При иммуноцитохимической реакции у них обнаруживаются округлоовальные тела, 1 или 2 коротких отростка (см. рисунок, г). Однако неравномерность иммунопозитивного осадка в отростках этих клеток не позволяет более детально охарактеризовать их особенности. Исследование препаратов, импрегнированных нитратом серебра по методу Гольджи (см. рисунок, в), показало, что в субвентрикулярной зоне клетки имеют небольшое и округлое по форме тело. У них выявляется, как правило, один отросток, который разветвляется на небольшом расстоянии от тела клетки. Обсуждение полученных данных. Клетки, выявленные нами при импрегнации нитратом серебра по Гольджи по морфологическим признакам согласно классификации Т. А. Леонтович [3], можно отнести к нейробластоморфным нейронам. Общепризнано, что субвентрикулярная зона мозга у взрослых представляет собой важный отдел, содержащий прогениторные нейрональные клетки, который может быть использован при нейрорегенеративной терапии [4]. Считали, что генерация прогениторных нейрональных клеток представлена только в ее переднем отделе с последующей их миграцией по ростральному пути в обонятельную луковицу. В последующем было показано, что этот процесс происходит на всем протяжении субвентрикулярной зоны, прогениторные нейрональные клетки которой могут быть источником новых нейронов и клеток глии. Выявленная в нашей работе способность клеток субвентрикулярной зоны нижнего рога бокового желудочка, который входит в состав палеоамигдалы, экспрессировать CARTпептид показывает, что его синтез происходит в норме, и этот процесс является физиологическим. Интраназальное введение CART-пептида в мозг [5] приводит к стимуляции уже отработанного в эволюции физиологического механизма, что предопределяет высокую эффективность нейрорегенеративной терапии, проводимой с его использованием. Полученные в нашей работе данные показывают, что синтез CART-пептида в клетках субвентрикулярной зоны нижнего рога бокового желудочка происходит в условиях нормы и, вероятно, отражает его участие в процессах физиологической регенерации. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Л. Б. К., А. В. А. Сбор и обработка материала: А. А. Н., А. В. А. Анализ и интерпретация данных: Е. Н. Е., Л. Б. К. Написание текста: А. В. А., Л. Б. К. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

A. V. Akhmadeyev

Bashkir State University

Department of Life Safety and Environmental Protection

L. B. Kalimullina

Bashkir State University

Department of Life Safety and Environmental Protection

A. A. Nurutdinov

Bashkir State University

Department of Life Safety and Environmental Protection

Ye. N. Yelizaryeva

Bashkir State University

Email: mpha@ufanet.ru
Department of Life Safety and Environmental Protection

References

Supplementary files