MORPHOMETRIC ANALYSIS OF BLOOD VESSELS OF TIBIAL REGENERATE IN TIBIA AUTOMATIC LENGTHENING AT AN INCREASED RATE

Full Text

Удлинение укороченных конечностей остается актуальной проблемой, требующей решения на новом теоретическом и технологическом уровнях [6]. В современной ортопедии задача коррекции длины сегмента конечности решается хирургическими средствами, в том числе методом дистракционного остеосинтеза, разработанным акад. Г. А. Илизаровым. Продолжается поиск приемов, позволяющих сократить аппаратный период с сохранением условий для активного остеогенеза и адекватного кровоснабжения [11], от которых зависит конечный результат лечения [9]. Известно, что при удлинении голени с темпом 1 мм увеличение дробности до 60 приемов с применением автоматических приводов создаются более благоприятные условия для кровоснабжения и остеогенеза в формирующемся участке диафиза кости по сравнению с известными ручными режимами [5]. Однако одновременно достаточно часто происходит преждевременная оссификация регенерата, что делает невозможным дальнейшее удлинение кости, либо приводит к разрыву дистракционного регенерата и длительному формированию консолидации его фрагментов в зоне разрыва [8]. В связи с этим возникла идея, что в условиях высокой дробности для предупреждения преждевременной оссификации «зоны роста» нужно применять более высокие суточные темпы, позволяющие не только удлинять кость на нужную величину, но и сокращать аппаратный период. В настоящее время имеются результаты, показывающие возможность увеличения суточного темпа до 3 мм в условиях высокой дробности при автоматическом удлинении голени [2, 3, 6]. Основанием для применения данного режима, позволяющего сократить аппаратный период дистракционного остеосинтеза на 30-31%, являются значительный репаративный потенциал костной ткани большеберцовой кости и отсутствие необратимых деструктивных изменений в смежных суставах, мышцах и нервах [1, 3, 7, 10]. Для выяснения механизмов репаративных процессов костной ткани необходим анализ кровоснабжения формирующегося участка кости на различных этапах остеосинтеза. Целью настоящего исследования явилось изучение динамики морфометрических параметров кровеносных сосудов в дистракционном регенерате большеберцовой кости собак на различных этапах ускоренного автоматического удлинения голени. Материал и методы. Экспериментальное исследование выполнено на аутопсийном материале регенератов диафизов большеберцовых костей 15 прооперированных, а также большеберцовых костей 10 интактных взрослых беспородных собак. Содержание, операции и эвтаназию животных осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утверждённых приказом МЗ СССР № 755 от 12 августа 1977 г. и Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996). Разрешение на проведение данного исследования отражено в протоколе заседания локального этического комитета № 3(16) от 02.09.2013 г. Животным под тиопенталовым наркозом монтировали на голень аппарат Илизарова, после чего осуществляли флексионную остеоклазию большеберцовых костей в средней трети диафиза (операции выполнены канд. вет. наук М. А. Степановым). Через 5 сут после операции начинали удлинение голени методом чрескостного дистрационного остеосинтеза при помощи автоматического привода с темпом 3 мм/сут за 120 приемов до достижения средней величины удлинения в 15% от длины диафиза. Собак выводили из опыта передозировкой барбитуратов через 10 сут дистракции, 30 сут фиксации и 30 сут после снятия аппарата. Фрагменты регенератов диафизов большеберцовых костей животных, выведенных из эксперимента по окончанию периода дистракции, вырезали из зон проксимального (З1) и дистального (З5) костных отломков, проксимального (З2) и дистального (З4) костных отделов регенерата и срединной соединительнотканной прослойки (З3), так называемой «зоны роста» (рисунок, а). На остальных этапах эксперимента фрагменты извлекали из аналогичных участков кости для оценки изменений в изучаемых зонах (см. рисунок, б, в). Фиксацию образцов осуществляли в смеси 2% растворов параформальдегида и глутаральдегида с добавлением фосфатного буфера (рН 7,4). После фиксации одну часть кусочков обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации (от 70 до 100%), безводном ацетоне и заключали в аралдит, другую - декальцинировали трилоном Б, дегидратировали и заключали в парафин. На поперечных парафиновых срезах кости кровеносные сосуды выявляли гематоксилином - эозином, а также орсеином по Тенцеру-Унну, а полутонкие срезы обрабатывали метиленовым синим с постановкой ШИК-реакции. Препараты изучали при помощи светового микроскопа «Opton» (Германия) и аппаратно-программного комплекса «ДиаМорф» (Россия) при общем увеличении микроскопа 400. С помощью программы-анализатора изображений «ВидеоТесТ-Морфология 4.0» (Россия) определяли диаметр сосудов (Д) и их численную плотность (ЧПл) в поле зрения микроскопа в исследованных участках регенерата, затем пересчитывали их число на 10 мм2. Подсчитывали число сосудов артериального типа (артерии и артериолы) и венозного типа (вены и венулы). Статистическую обработку проводили с использованием приложения Microsoft Excel. Значимость различий средних величин изучаемых показателей в различные периоды эксперимента и по сравнению с контролем оценивали при помощи двухвыборочного t-критерия Стьюдента и считали их значимыми при р<0,05. Результаты исследования. Через 10 сут дистракции ЧПл артериального типа была меньше в З1 и З5 на 10±0,5 и 29,1%, в З2 и З4 - на 42,7 и 36,2%, в З3 - на 75,2% соответственно по сравнению с показателями у интактных животных (табл. 1). Показатели ЧПл венозного типа были снижены в З1 и З5 в среднем на 13,9 и 10,4%, в З2 и З4 - на 21 и 22,6%, в З3 - на 75,8% соответственно по сравнению с контролем. ЧПл капиллярного типа во всех исследуемых зонах регенерата была значимо выше по сравнению с показателями у интактных животных: в З1 и З5 - в 2-2,5 раза, в З3 - в 3,7 раза. Через 30 сут фиксации показатели ЧПл сосудов артериального звена в разных зонах регенерата изменялись неодинаково: в З1 - уменьшились на 13,1%, в З4 - оставались стабильными, в З2, З3 и З5 - увеличились на 37,3, 106,6 и 21,4% соответственно по сравнению с показателями предыдущего этапа. По сравнению с контролем ЧПл артериального типа была значимо меньше: в области З1 и З5 - на 21,7 и 13,8%, в области З2 и З4 - в среднем на 37%, в З3 - на 51,1% соответственно. По сравнению с предыдущим этапом дистракции ЧПл венозного типа в разных исследованных зонах регенерата также изменялась неодинаково: в З1 она уменьшалась на 21%, в З2 и З5 - увеличивалась на 8,3±0,5 и 8,8±0,4%, в З4 - оставалась стабильной, в области З3 - увеличивалась в 2,5 раза. В то же время, по сравнению с контролем ЧПл венозного типа оставалась сниженной в З1 и З5 - на 22 и 13,9%, в З2, З3, З4 - в среднем на 37-40% соответственно. ЧПл капиллярного типа по сравнению с периодом дистракции уменьшалась в З5 на 36,3%, в З2 и З4 - в 1,6-2,0 раза, в З5 - в 2,8 раза, а в З1 - увеличилась на 12, 6%. Однако по сравнению с контролем она была выше нормы в З2 и З4 на 63,5 и 25%, в З1 и З5 - на 40,1 и 41,2%, в З5 - на 81,9%. Через 1 мес после демонтажа аппарата по сравнению с периодом фиксации ЧПл артериального типа увеличивалась в З1 на 30,4%, в З2 и З4 - на 7,8±0,5 и 35,8%, в З3 - на 52%, в З5 - не изменялась. ЧПл венозного типа также увеличивалась в З1 и З5 на 27,7 и 15,6%, в З2 и З4 - на 52,75 и 56,79%, в З3 - на 79,97%. Однако ЧПл капиллярного типа, напротив, уменьшалась в З1 и З5 на 33,6 и 16%, в З2 и З4 - на 10,36 и 23,2%, в З3 - на 32,14% соответственно. По сравнению с контролем ЧПл венозного и артериального типов в З1, З4 и З5 не имела значимых различий. Однако в З2 и З3 ЧПл артериального типа была ниже нормы на 4,2±1,2 и 8,6±0,1%, венозного типа - на 7,4±0,5 и 8,7±0,9% соответственно. Значения ЧПл капиллярного типа на уровне З1 и З5 были максимально приближены к норме. В зонах З2, З3 и З4 ЧПл оставалась повышенной относительно контроля на 25, 23,6 и 14,6% соответственно. К окончанию периода удлинения диаметр вен уменьшался по сравнению с контролем в З1 и З5 на 27,4 и 29,2%, в З2 и З4 - на 22,7 и 27%, в З3 - на 38,8%. Д венул во всех зонах был выше, чем в контроле - на 26,9-37,4%. Д сосудов капиллярного типа в З1 и З5 практически не отличался от такового у интактных собак, а в З2, З3 и З4 был больше на 14,9, 71,6 и 21% соответственно. Д артериол во всех исследуемых зонах, напротив, был меньше, чем в контроле: в зонах отломков З1 и З5 - на 30,9 и 21,2% соответственно, в зонах регенерата З2, З3, З4 - на 15,1, 11,5, 8,9±1,6%. Д артерий в З1 и З5 был приближен к норме, а в З2, З3 и З4 - был выше, чем у интактных собак на 15, 101 и 6,7±0,2% соответственно (табл. 2). Через 30 сут фиксации по сравнению с периодом дистракции Д вен в З1 и З3 не изменялся, а в З2, З4 и З5 - уменьшался на 19,7, 15,8 и 9,2% соответственно. По сравнению с контролем наибольшее сужение просветов вен и венул отмечено в участках З1 и З5, где их диаметр уменьшался на 41,9-43,5%, в других участках Д венозных сосудов уменьшался на 33,2-37,4%. По сравнению с периодом дистракции Д венул в З1 и З5 уменьшался на 33,4 и 23%, в З2 и З3 - не изменялся, а в З4 - увеличивался на 33,3%. По сравнению с интактными животными данный показатель в З1 и З5 не имел значимых различий, а в З2, З3 и З4 он увеличивался на 60,6, 48,8 и 90,2%. Относительно предыдущего этапа эксперимента Д капилляров в З3 и З4 уменьшался на 35,6 и 11,8%, в остальных зонах - не изменялся. В то же время, по сравнению с контролем в З2 и З3 он был увеличен на 16,8 и 19,6%, а в З1, З4 и З5 - приближен к значениям у интактных животных. Д артериол по сравнению с периодом дистракции увеличивался в З1, З2, З3 З4 и З5 на 46, 23,5, 34, 39 и 52% соответственно. Показатели Д артериол были больше, чем у интактных животных в разных зонах на 24,4-79,0%, значительнее отклоняясь от нормы в З4 и З5. Д артерий по отношению к предыдущему этапу в З1, З4 и З5 увеличивался на 28,2, 24,9 и 20,73%, в З2 и З3 - не изменялся. По сравнению с показателями у интактных животных Д артерий увеличивался в зонах новообразованного участка диафиза в З2 на 60,63%, в З3 - на 90,2%, в З4 - на 48,8%. В З1 и З5 он увеличивался менее значительно - на 12,9-14,6%. Через 30 сут после снятия аппарата Д сосудов венозного типа по сравнению с этапом фиксации во всех зонах практически не изменялся и был меньше показателей у интактных животных на 31,1-38,4%. Д венул в сравнении с предыдущим этапом уменьшался в З3 на 7,76%, в области З2 и З4 - на 25,54 и 74,8%. По сравнению с показателями у интактных животных Д венул на уровне З1 не изменялся, в З5 - увеличивался на 15,4%, в З2, З3 и З4 нарастал на 39, 12,5, 32,1%. Д капилляров по сравнению с окончанием периода фиксации в З1 увеличился на 16,7%, в З5 - не изменился, в З2, З3 и З4 - уменьшался на 14,2, 35, 7,7±1,4%. На этом этапе эксперимента Д капилляров во всех зонах не отличался от показателей у интактных животных. Диаметр артериол относительно периода фиксации уменьшался в З1 и З5 на 19,3 и 84,3%, в З3 и З4 - на 11,8 и 11,9%, но в З2 -увеличивался на 37%. По сравнению с контролем Д артериол увеличивался в З1 на 8,7±0,4%, в З2, З3 и З4 - на 34,6, 21,6, 24,9% соответственно, а в З5 - не отличался от контрольных показателей. По сравнению с периодом фиксации Д артерий уменьшался во всех зонах: в З1 и З5 - на 9,8±1,8 и 7,9±0,1%, в З2 и З4 - на 5,9±0,1 и 19,5%, в З3 - на 40,4%. Д артерий на уровне З1 и З5 не отличался от показателей у интактных животных, а в З2, З3 и З4 - был выше контрольных значений на 9,4±0,7, 45,8 и 22,5%. Обсуждение полученных данных. В результате проведенного исследования выявлено, что собственно оперативное вмешательство, а также дистракция костных фрагментов с повышенным темпом сопровождались изменениями сосудов кости. Репаративные процессы в удлиняемой кости происходят на фоне посттравматического состояния вазодилатации вен, расширения просвета артерий, снижения численной плотности сосудов артериального и венозного типа и увеличения численной плотности капилляров. Максимальные изменения отмечены в области соединительнотканной прослойки в «зоне роста» кости. Кровоток в микроциркуляторном русле этой зоны осуществляется за счет сужения просветов артериол и расширения его у капилляров и венул. Уменьшение внутреннего диаметра вен, наблюдаемое в период дистракции, мы связываем с состоянием вазодилатации. По мнению некоторых авторов, оно может развиваться вследствие увеличения общего объема сосудистой системы кости в результате неоваскулогенеза, в котором перераспределяется поступающий объем крови [9, 11, 12]. В постдистракционный период уменьшение среднего диаметра вен объясняется появлением более тонких новообразованных сосудов венозного типа [4]. Увеличение внутренних диаметров венул, капилляров и артерий на 20-80% в периоде дистракции, возможно, вызвано раздражением механорецепторов надкостницы в результате сдавливающего воздействия мышечного массива в связи с его растяжением в результате удлинения голени, а также запуском механизмов эндокринной регуляции, связанной с нарушением целостности кости [4]. Расширение просветов артерий также может быть связано и со снижением их тонуса при уменьшении поступающего объема крови в результате травмы [11]. В связи с этим уменьшение просвета артериол в зонах регенерата и отломков объясняется их ответной реакцией для обеспечения достаточного кровотока в регенерате. Увеличение ЧПл микрососудов свидетельствует о неоваскулогенезе, индуцированном влиянием дистракции, способствующей образованию ангиогенных факторов, стимулирующих новообразование и структурную перестройку уже существовавших кровеносных сосудов [14], а также воздействием гемодинамических факторов [4]. В период фиксации характер изменений вен, артерий, венул и капилляров сохраняется с меньшей выраженностью. Наблюдается расширение артериол, что свидетельствует об увеличении кровенаполнения микрососудов [9]. В безаппаратный период зональные изменения сглажены, наблюдается достоверное уменьшение ЧПл капилляров и диаметров микрососудов. Однако вследствие незаконченной перестройки сосудистого русла некоторые показатели еще сохраняют значимые различия по сравнению с интактными животными. Таким образом, активный остеогенез в период дистракции осуществляется благодаря достаточному кровоснабжению за счет увеличения общего объема сосудистого бассейна в зоне формирующегося регенерата. Этот процесс обеспечивается новообразованием сосудов капиллярного русла. Наблюдаемые вазодилатация вен и расширение просветов артерий можно рассматривать как приспособительный механизм регуляции кровотока для осуществления достаточного метаболизма, способствующего новообразованию костной ткани. Параллельная перестройка сосудистого русла и костной ткани на последующих этапах эксперимента связана с ранней нагрузкой на конечность. Следовательно, данные об особенностях кровоснабжения кости в условиях удлинения голени с повышенным до 3 мм суточным темпом свидетельствуют о том, что при сокращении периода дистракции втрое, а общего аппаратного периода на 30-31% не нарушаются закономерности адаптации сосудистого русла к условиям удлинения с меньшими темпами [4, 5, 13]. Автор сообщает об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

Ye. N. Gorbach

«Restorative Traumatology and Orthopaedics» Russian Federal State Ilizarov Scientific Center

Email: gorbach.e@mail.ru

References

Supplementary files