ЭКСПРЕССИЯ КОЛЛАГЕНА I ТИПА, СИРТУИНА-6 И МАТРИКСНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ-1 В ФИБРОБЛАСТАХ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА В ПРОЦЕССЕ ДЛИТЕЛЬНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Полный текст

Возрастные изменения кожи являются проявлением общебиологического процесса старения и подчинены законам фундаментальной геронтологии. С другой стороны - кожа, в отличие от внутренних органов, выполняет барьерную функцию, подвергаясь воздействию агрессивных антропогенных факторов внешней среды, что является одной из возможных причин ее ускоренного старения [1, 4]. В основе возрастных изменений кожи лежит, прежде всего, нарушение микроциркуляции, сопровождающееся застойными явлениями в интерстиции, истончением дермо-эпидермального соединения, уменьшением численности фибробластов, изменением соотношения коллагенов I и III типов в сторону увеличения коллагена I типа, повышением вязкости основного вещества дермы, нарушением водно-электролитного баланса кожи и усилением трансэпидермальной потери воды [5]. Ранее с использованием метода иммунофлюоресцентной конфокальной микроскопии было изучено влияние белка Ki-67 на процессы пролиферации, пептида CD98hc - на регенерацию и старение, каспазы-3 - на апоптоз, ММР-9 - на ремоделирование межклеточного матрикса в фибробластах кожи при их старении в культуре пассажами [2]. Было установлено, что пептиды снижают синтез ММР-9, повышающейся при старении фибробластов кожи, и увеличивают экспрессию молекул Ki-67, CD98hc, синтез которых при клеточном старении снижается. Пептиды также снижают выраженность каспаза-зависимого апоптоза, повышающегося при старении культур клеток. Однако изученные в работе маркеры скорее можно отнести к молекулам, характеризующим функциональную активность (1:100, Abcam, США), сиртуину-6 (1:200, Abcam, США), фибробластов кожи, чем к маркерам ее возрастной инволюции. Молекулярно-клеточные механизмы старения кожи в настоящее время изучены недостаточно. В связи с этим целью работы явился поиск наиболее информативных маркеров старения фибробластов кожи в модели in vitro. Материал и методы. Фибробласты кожи женщины (1970 г.р.) выделяли из кожи околоушной области, полученной в результате операции по круговой подтяжке лица в клинике «Fijie» (Санкт-Петербург). Получено разрешение локального этического комитета (№ 4/1 от 30.11. 2013 г.) и информированное согласие пациентки на использование материала кожи для проведения данного исследования. Кожу обрабатывали в стерильных условиях раствором диспазы II в концентрации 2,4 ЕД/мл в течение 18 ч при 4 ºС, после чего механически отделяли эпидермис от дермы. Для получения суспензии клеток дерму измельчали ножницами до кусочков размером 2-3 мм и помещали в раствор коллагеназы I типа в среде M199. Полученную суспензию клеток осаждали при 1 g в течение 5 мин, после чего осадок клеток ресуспендировали в питательной среде, состоящей из среды M199, 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 1% L-глютамина, 1,5% Hepes-буфера и смеси пенициллина и стрептомицина. Через 5 дней первичная культура достигала монослоя, после чего проводили процедуру ее пересеивания. Для снятия клеток с подложки использовали раствор трипсин-версена (Gibco, ES), который добавляли по 500 мкл на флакон, время действия - 3 мин при температуре 37 ºС. Открепление клеток от подложки контролировали под микроскопом. Для блокирования ферментативной реакции добавляли полную питательную среду по 5 мл на флакон. Затем суспензию клеток центрифугировали 5 мин при 1000 g. Этот пассаж считали нулевым. Посевная концентрация составила 50 тыс. клеток на 1 мл среды. Пассирование производили через 3 дня на 4-й, когда культура достигала состояния монослоя. Культивирование проводили до 3-го и 14-го пассажа, на котором клетки рассеивали на планшет и производили иммуноцитохимическое окрашивание. В соответствии с рекомендацией Международной ассоциации исследований клеточных культур (Сан-Франциско, 2007), 3-й пассаж расценивали как «молодые» культуры, а 14-й - как «старые». Для проведения пермеабилизации использовали 0,1% Тритон X-100 (БиолоТ, Россия), растворенный в фосфатно-солевом буфере. Затем культуры клеток инкубировали в 1% фосфатносолевом буфере (pH 7,5) в течение 30 мин для блокировки неспецифического связывания. Инкубацию с первичными антителами проводили в течение 60 мин. В работе использовали первичные моноклональные антитела к коллагену I типа MMP-1 (1:150, Abcam, США). Конфокальную микроскопию клеток проводили в инвертированном конфокальном микроскопе Fluoview CM FV300- IX70 (Olympus, Япония) с использованием апохроматического объектива 606 UPlan. Для спецификации флюоресценции исследуемых маркеров использовали волну возбуждения аргонового лазера 488 нм. Ядра клеток докрашивали реактивом Hoechst 33258 (Sigma, США), в результате чего они флюоресцировали темно-синим цветом. Зеленая или красная флюоресценция показывала экспрессию исследуемых маркеров в результате инкубации со вторичными антителами, конъюгированными с флюорохромом Alexa Fluor 488 (1:1000; Abcam, США) или Alexa Fluor 647 (1:1000, Abcam, США), в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Готовые препараты заключали под покровные стекла в монтирующую среду Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako, США). Для анализа полученных результатов использовали отечественное программное обеспечение «ВидеоТест-Морфология 5.2». В каждом случае анализировали 5 полей зрения при увеличении 200. Площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Этот параметр характеризует количество клеток, в которых экспрессируется исследуемый маркер. Также в условных единицах (у. е.) оценивали оптическую плотность экспрессии, отражающую количество исследуемого маркера, синтезируемого в одной клетке. Статистическую обработку данных проводили в программе «Statistica 6.0», она включала подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения и доверительного интервала для каждой выборки. Для анализа вида распределения использовали критерий Шапиро-Уилка. Проверку статистической однородности нескольких выборок производили с использованием непараметрических процедур однофакторного дисперсионного анализа (критерий Крускала- Уоллиса). В случаях, когда дисперсионный анализ выявлял статистически значимую неоднородность нескольких выборок, для последующего выявления неоднородных групп применяли процедуры множественных сравнений с помощью U-критерия Манна-Уитни. Критический уровень достоверности нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0,05. Результаты исследования. Площадь экспрессии коллагена I типа в «старых» культурах фибробластов была в 3,5 раза ниже, чем в «молодых» культурах (таблица). При этом оптическая плотность экспрессии коллагена I типа в «молодых» и «старых» культурах фибробластов кожи достоверно не различается (см. таблицу). Полученные данные свидетельствуют о том, что при старении количество фибробластов кожи, в которых происходит активный синтез коллагена I типа, снижается. Однако в тех «старых» фибробластах, в которых синтез коллагена происходит, активность этого процесса остается на уровне «молодых» клеток (рис. 1). На рис. 1, б заметны флюоресцентно идентифицируемые синие ядра клеток, вокруг которых не наблюдается синтеза коллагена (вокруг ядер отсутствует зеленое иммуноокрашивание), тогда как на рис. 1, а во всех клетках хорошо различима реакция на коллаген I типа. Площадь экспрессии ММР-1 в «старых» культурах фибробластов была в 2,5 раза выше, чем в «молодых» культурах (см. таблицу). Такая же тенденция наблюдалась и для оптической плотности. Оптическая плотность экспрессии ММР-1 в «старых» культурах фибробластов кожи была в 1,6 раза ниже, чем в «молодых» клетках. Полученные данные свидетельствуют о том, что при старении количество фибробластов кожи, в которых синтезируется ММР-1, повышается. Одновременно при старении в культуре в каждом фибробласте синтез ММР-1 возрастает по сравнению с «молодыми» клетками. Площадь экспрессии сиртуина-6 в «старых» культурах фибробластов была в 3,6 раза ниже, чем в «молодых» культурах. Такая же тенденция наблюдалась и для оптической плотности экспрессии сиртуина-6: в «старых» культурах фибробластов кожи она была в 2,6 раза ниже, чем в «молодых» клетках. Полученные данные свидетельствуют о том, что при старении количество фибробластов кожи, в которых синтезируется сиртуин-6, снижается. Одновременно в «старых» фибробластах, в которых синтез сиртуина-6 все-таки наблюдается, активность этого процесса снижается по сравнению с «молодыми» фибробластами (рис. 2). На рис. 2, б заметно снижение количества флюоресцентно окрашенных на сиртуин-6 розовых ядер клеток, при этом в тех клетках, в которых розовая иммунофлюоресценция все-таки наблюдается, ее интенсивность (яркость) заметно ниже, чем на рис. 2, а. Обсуждение полученных данных. Удельный вес коллагена в коже снижается при хронологическом старении и фотостарении. Ранее в ходе морфометрических исследований кожи живота пациентов разных возрастных групп (от 10 до 75 лет) рядом авторов выявлено прогрессивное уменьшение доли соединительной ткани, содержащей коллагеновые волокна, с возрастом пациентов [3]. Эти изменения были более выражены в средней части дермы и достигали существенных величин уже к 50 годам. При этом происходило снижение синтеза коллагена I и III типов. Темпы снижения первого более значимы, в связи с этим изменялось соотношение коллагена III и I типа (у молодых - 15 и 80% соответственно), коррелирующее с возрастом пациентов [13]. Эти данные согласуются с полученными нами результатами, свидетельствующими о том, что площадь экспрессии коллагена I типа в «старых» культурах фибробластов в 3,5 раза ниже, чем в «молодых» культурах. В 2001 г. J. Varani и соавт. в серии опытов in vitro продемонстрировали, что добавление в культуру фибробластов деградированного коллагена подавляет их синтетическую активность, а добавление интактного коллагена не приводит к аналогичному эффекту. Таким образом, аккумуляция с возрастом частично деградированного коллагена является одной из причин снижения синтеза проколлагена фибробластами [12]. Позднее стало очевидным, что процесс клеточного старения фибробластов является следствием снижения их механической стимуляции деградированным коллагеном [8]. На поверхности фибробластов имеются рецепторы (интегрины), обеспечивающие связь актина клеточного цитоскелета с белками основного вещества дермы, в первую очередь коллагеном I типа. Адгезия и взаимное механическое напряжение между фибробластами и коллагеном дермы вовлечены в регуляцию целого ряда клеточных процессов, включая передачу сигналов, экспрессию генов и обмен веществ. Эти процессы регулируют метаболизм фибробластов, в том числе баланс между производством коллагена I типа и его разрушением матриксной металлопротеиназой (ММР-1), обеспечивают способность клеток к миграции, а также обеспечивают механическое натяжение их цитоскелета и поддержание формы клетки, динамическое напряжение между фибробластами и коллагеновыми волокнами. В нашем исследовании синтез ММР-1 в фибробластах кожи при их старении возрастал в 1,6 раза на фоне снижения синтеза коллагена I типа. Эти данные хорошо согласуются с приведенными выше результатами, полученными другими исследователями, и могут указывать на то, что при старении матриксные металлопротеиназы активно расщепляют коллаген I типа, синтезируемый фибробластами кожи, а синтез нового коллагена замедляется, т.е. происходит дисбаланс этих процессов. Белок сиртуин-6 (SIRT-6) является критическим регулятором транскрипции стабильности генома, длины теломер, репарации ДНК и метаболического гомеостаза [11]. Опубликованные ранее данные свидетельствуют о том, что повышенная экспрессия гена сиртуина-6 на 15,8% увеличивает продолжительность жизни мышейсамцов [9]. У нокаунтных по сиртуину-6 мышей наблюдались фенотип преждевременного старения, тяжелая лимфопения, потеря подкожного жира, остеопения и нарушение обмена веществ. Такие мыши погибали в молодом возрасте [7]. Сиртуин-6 модулирует теломерный хроматин, деацетилируя лизин- 9 гистона H3 и предотвращая теломерную дисфункцию и раннее клеточное старение [10]. При изучении фибробластов кожи человека с молчащим геном сиртуина-6 было показано, что он ингибирует транскрипцию гена, ответственного за синтез коллагена I типа (COL1A1), и повышает секрецию ММР-1 [6]. Как полагают авторы работы, полученные результаты свидетельствуют о том, что нокдаун гена сиртуина-6 может влиять на синтез и деградацию коллагена [6]. Выявленное нами одновременное снижение синтеза коллагена I типа и сиртуина-6 при повышении экспрессии ММР-1 в фибробластах кожи человека при их старении в культуре полностью подтверждает это предположение. Выявленное нами снижение синтеза сиртуина-6 в фибробластах кожи при их старении в культуре может указывать на общебиологические процессы старения клеток кожи и снижение стабильности генома фибробластов. Выводы. Установлено, что при старении фибробластов кожи человека в культуре в них снижается экспрессия коллагена I типа и сиртуина-6, и одновременно возрастает экспрессия ММР-1. Вероятно, эти процессы тесно связаны между собой. Таким образом, выявленный нами паттерн изменения экспрессии коллагена I типа, сиртуина-6 и ММР-1 может характеризовать процессы старения фибробластов кожи. Поскольку результаты были получены нами на первичной культуре фибробластов кожи одного человека, в дальнейшем планируется получение аналогичных культур от других пациентов с целью уточнения представленных данных. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: И. М. К., В. Х. Х. Сбор и обработка материала: Н. В. Ф., А. О. Д. Статистическая обработка данных: А. В. Д. Анализ и интерпретация данных: С. В. Т., В. О. П. Написание текста: Н. С. Л. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

Об авторах

Наталья Владимировна Фридман

Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии

Email: ibg@gerontology.ru
Отдел биогеронтологии

Наталья Сергеевна Линькова

Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии; Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого

Email: miayy@yandex.ru
Отдел биогеронтологии; кафедра «Медицинская физика»

Виктория Олеговна Полякова

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д. О. Отта; Санкт-Петербургский государственный университет

Email: vopol@yandex.ru
отдел патоморфологии; кафедры патологии и физиологии

Анна Олеговна Дробинцева

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д. О. Отта; Педиатрический университет

Email: anna-flor@mail.ru
отдел патоморфологии; кафедра медицинской биологии

Светлана Владиславовна Трофимова

Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии

Email: dr.s.trofimova@gmail.com
Отдел биогеронтологии

Александр Владимирович Дудков

Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии

Отдел биогеронтологии

Владимир Хацкелевич Хавинсон

Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии; Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН

Отдел биогеронтологии; группа пептидной регуляции старения

Игорь Моисеевич Кветной

Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии; Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д. О. Отта; Санкт-Петербургский государственный университет

Отдел биогеронтологии; отдел патоморфологии; кафедры патологии и физиологии

Список литературы

Дополнительные файлы