TYPE I COLLAGEN, SIRTUIN-6, AND MATRIX METALLOPROTEINASE-1 EXPRESSION IN HUMAN SKIN FIBROBLASTS DURING LONG-TERM CULTIVATION

Full Text

Возрастные изменения кожи являются проявлением общебиологического процесса старения и подчинены законам фундаментальной геронтологии. С другой стороны - кожа, в отличие от внутренних органов, выполняет барьерную функцию, подвергаясь воздействию агрессивных антропогенных факторов внешней среды, что является одной из возможных причин ее ускоренного старения [1, 4]. В основе возрастных изменений кожи лежит, прежде всего, нарушение микроциркуляции, сопровождающееся застойными явлениями в интерстиции, истончением дермо-эпидермального соединения, уменьшением численности фибробластов, изменением соотношения коллагенов I и III типов в сторону увеличения коллагена I типа, повышением вязкости основного вещества дермы, нарушением водно-электролитного баланса кожи и усилением трансэпидермальной потери воды [5]. Ранее с использованием метода иммунофлюоресцентной конфокальной микроскопии было изучено влияние белка Ki-67 на процессы пролиферации, пептида CD98hc - на регенерацию и старение, каспазы-3 - на апоптоз, ММР-9 - на ремоделирование межклеточного матрикса в фибробластах кожи при их старении в культуре пассажами [2]. Было установлено, что пептиды снижают синтез ММР-9, повышающейся при старении фибробластов кожи, и увеличивают экспрессию молекул Ki-67, CD98hc, синтез которых при клеточном старении снижается. Пептиды также снижают выраженность каспаза-зависимого апоптоза, повышающегося при старении культур клеток. Однако изученные в работе маркеры скорее можно отнести к молекулам, характеризующим функциональную активность (1:100, Abcam, США), сиртуину-6 (1:200, Abcam, США), фибробластов кожи, чем к маркерам ее возрастной инволюции. Молекулярно-клеточные механизмы старения кожи в настоящее время изучены недостаточно. В связи с этим целью работы явился поиск наиболее информативных маркеров старения фибробластов кожи в модели in vitro. Материал и методы. Фибробласты кожи женщины (1970 г.р.) выделяли из кожи околоушной области, полученной в результате операции по круговой подтяжке лица в клинике «Fijie» (Санкт-Петербург). Получено разрешение локального этического комитета (№ 4/1 от 30.11. 2013 г.) и информированное согласие пациентки на использование материала кожи для проведения данного исследования. Кожу обрабатывали в стерильных условиях раствором диспазы II в концентрации 2,4 ЕД/мл в течение 18 ч при 4 ºС, после чего механически отделяли эпидермис от дермы. Для получения суспензии клеток дерму измельчали ножницами до кусочков размером 2-3 мм и помещали в раствор коллагеназы I типа в среде M199. Полученную суспензию клеток осаждали при 1 g в течение 5 мин, после чего осадок клеток ресуспендировали в питательной среде, состоящей из среды M199, 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 1% L-глютамина, 1,5% Hepes-буфера и смеси пенициллина и стрептомицина. Через 5 дней первичная культура достигала монослоя, после чего проводили процедуру ее пересеивания. Для снятия клеток с подложки использовали раствор трипсин-версена (Gibco, ES), который добавляли по 500 мкл на флакон, время действия - 3 мин при температуре 37 ºС. Открепление клеток от подложки контролировали под микроскопом. Для блокирования ферментативной реакции добавляли полную питательную среду по 5 мл на флакон. Затем суспензию клеток центрифугировали 5 мин при 1000 g. Этот пассаж считали нулевым. Посевная концентрация составила 50 тыс. клеток на 1 мл среды. Пассирование производили через 3 дня на 4-й, когда культура достигала состояния монослоя. Культивирование проводили до 3-го и 14-го пассажа, на котором клетки рассеивали на планшет и производили иммуноцитохимическое окрашивание. В соответствии с рекомендацией Международной ассоциации исследований клеточных культур (Сан-Франциско, 2007), 3-й пассаж расценивали как «молодые» культуры, а 14-й - как «старые». Для проведения пермеабилизации использовали 0,1% Тритон X-100 (БиолоТ, Россия), растворенный в фосфатно-солевом буфере. Затем культуры клеток инкубировали в 1% фосфатносолевом буфере (pH 7,5) в течение 30 мин для блокировки неспецифического связывания. Инкубацию с первичными антителами проводили в течение 60 мин. В работе использовали первичные моноклональные антитела к коллагену I типа MMP-1 (1:150, Abcam, США). Конфокальную микроскопию клеток проводили в инвертированном конфокальном микроскопе Fluoview CM FV300- IX70 (Olympus, Япония) с использованием апохроматического объектива 606 UPlan. Для спецификации флюоресценции исследуемых маркеров использовали волну возбуждения аргонового лазера 488 нм. Ядра клеток докрашивали реактивом Hoechst 33258 (Sigma, США), в результате чего они флюоресцировали темно-синим цветом. Зеленая или красная флюоресценция показывала экспрессию исследуемых маркеров в результате инкубации со вторичными антителами, конъюгированными с флюорохромом Alexa Fluor 488 (1:1000; Abcam, США) или Alexa Fluor 647 (1:1000, Abcam, США), в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Готовые препараты заключали под покровные стекла в монтирующую среду Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako, США). Для анализа полученных результатов использовали отечественное программное обеспечение «ВидеоТест-Морфология 5.2». В каждом случае анализировали 5 полей зрения при увеличении 200. Площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Этот параметр характеризует количество клеток, в которых экспрессируется исследуемый маркер. Также в условных единицах (у. е.) оценивали оптическую плотность экспрессии, отражающую количество исследуемого маркера, синтезируемого в одной клетке. Статистическую обработку данных проводили в программе «Statistica 6.0», она включала подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения и доверительного интервала для каждой выборки. Для анализа вида распределения использовали критерий Шапиро-Уилка. Проверку статистической однородности нескольких выборок производили с использованием непараметрических процедур однофакторного дисперсионного анализа (критерий Крускала- Уоллиса). В случаях, когда дисперсионный анализ выявлял статистически значимую неоднородность нескольких выборок, для последующего выявления неоднородных групп применяли процедуры множественных сравнений с помощью U-критерия Манна-Уитни. Критический уровень достоверности нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0,05. Результаты исследования. Площадь экспрессии коллагена I типа в «старых» культурах фибробластов была в 3,5 раза ниже, чем в «молодых» культурах (таблица). При этом оптическая плотность экспрессии коллагена I типа в «молодых» и «старых» культурах фибробластов кожи достоверно не различается (см. таблицу). Полученные данные свидетельствуют о том, что при старении количество фибробластов кожи, в которых происходит активный синтез коллагена I типа, снижается. Однако в тех «старых» фибробластах, в которых синтез коллагена происходит, активность этого процесса остается на уровне «молодых» клеток (рис. 1). На рис. 1, б заметны флюоресцентно идентифицируемые синие ядра клеток, вокруг которых не наблюдается синтеза коллагена (вокруг ядер отсутствует зеленое иммуноокрашивание), тогда как на рис. 1, а во всех клетках хорошо различима реакция на коллаген I типа. Площадь экспрессии ММР-1 в «старых» культурах фибробластов была в 2,5 раза выше, чем в «молодых» культурах (см. таблицу). Такая же тенденция наблюдалась и для оптической плотности. Оптическая плотность экспрессии ММР-1 в «старых» культурах фибробластов кожи была в 1,6 раза ниже, чем в «молодых» клетках. Полученные данные свидетельствуют о том, что при старении количество фибробластов кожи, в которых синтезируется ММР-1, повышается. Одновременно при старении в культуре в каждом фибробласте синтез ММР-1 возрастает по сравнению с «молодыми» клетками. Площадь экспрессии сиртуина-6 в «старых» культурах фибробластов была в 3,6 раза ниже, чем в «молодых» культурах. Такая же тенденция наблюдалась и для оптической плотности экспрессии сиртуина-6: в «старых» культурах фибробластов кожи она была в 2,6 раза ниже, чем в «молодых» клетках. Полученные данные свидетельствуют о том, что при старении количество фибробластов кожи, в которых синтезируется сиртуин-6, снижается. Одновременно в «старых» фибробластах, в которых синтез сиртуина-6 все-таки наблюдается, активность этого процесса снижается по сравнению с «молодыми» фибробластами (рис. 2). На рис. 2, б заметно снижение количества флюоресцентно окрашенных на сиртуин-6 розовых ядер клеток, при этом в тех клетках, в которых розовая иммунофлюоресценция все-таки наблюдается, ее интенсивность (яркость) заметно ниже, чем на рис. 2, а. Обсуждение полученных данных. Удельный вес коллагена в коже снижается при хронологическом старении и фотостарении. Ранее в ходе морфометрических исследований кожи живота пациентов разных возрастных групп (от 10 до 75 лет) рядом авторов выявлено прогрессивное уменьшение доли соединительной ткани, содержащей коллагеновые волокна, с возрастом пациентов [3]. Эти изменения были более выражены в средней части дермы и достигали существенных величин уже к 50 годам. При этом происходило снижение синтеза коллагена I и III типов. Темпы снижения первого более значимы, в связи с этим изменялось соотношение коллагена III и I типа (у молодых - 15 и 80% соответственно), коррелирующее с возрастом пациентов [13]. Эти данные согласуются с полученными нами результатами, свидетельствующими о том, что площадь экспрессии коллагена I типа в «старых» культурах фибробластов в 3,5 раза ниже, чем в «молодых» культурах. В 2001 г. J. Varani и соавт. в серии опытов in vitro продемонстрировали, что добавление в культуру фибробластов деградированного коллагена подавляет их синтетическую активность, а добавление интактного коллагена не приводит к аналогичному эффекту. Таким образом, аккумуляция с возрастом частично деградированного коллагена является одной из причин снижения синтеза проколлагена фибробластами [12]. Позднее стало очевидным, что процесс клеточного старения фибробластов является следствием снижения их механической стимуляции деградированным коллагеном [8]. На поверхности фибробластов имеются рецепторы (интегрины), обеспечивающие связь актина клеточного цитоскелета с белками основного вещества дермы, в первую очередь коллагеном I типа. Адгезия и взаимное механическое напряжение между фибробластами и коллагеном дермы вовлечены в регуляцию целого ряда клеточных процессов, включая передачу сигналов, экспрессию генов и обмен веществ. Эти процессы регулируют метаболизм фибробластов, в том числе баланс между производством коллагена I типа и его разрушением матриксной металлопротеиназой (ММР-1), обеспечивают способность клеток к миграции, а также обеспечивают механическое натяжение их цитоскелета и поддержание формы клетки, динамическое напряжение между фибробластами и коллагеновыми волокнами. В нашем исследовании синтез ММР-1 в фибробластах кожи при их старении возрастал в 1,6 раза на фоне снижения синтеза коллагена I типа. Эти данные хорошо согласуются с приведенными выше результатами, полученными другими исследователями, и могут указывать на то, что при старении матриксные металлопротеиназы активно расщепляют коллаген I типа, синтезируемый фибробластами кожи, а синтез нового коллагена замедляется, т.е. происходит дисбаланс этих процессов. Белок сиртуин-6 (SIRT-6) является критическим регулятором транскрипции стабильности генома, длины теломер, репарации ДНК и метаболического гомеостаза [11]. Опубликованные ранее данные свидетельствуют о том, что повышенная экспрессия гена сиртуина-6 на 15,8% увеличивает продолжительность жизни мышейсамцов [9]. У нокаунтных по сиртуину-6 мышей наблюдались фенотип преждевременного старения, тяжелая лимфопения, потеря подкожного жира, остеопения и нарушение обмена веществ. Такие мыши погибали в молодом возрасте [7]. Сиртуин-6 модулирует теломерный хроматин, деацетилируя лизин- 9 гистона H3 и предотвращая теломерную дисфункцию и раннее клеточное старение [10]. При изучении фибробластов кожи человека с молчащим геном сиртуина-6 было показано, что он ингибирует транскрипцию гена, ответственного за синтез коллагена I типа (COL1A1), и повышает секрецию ММР-1 [6]. Как полагают авторы работы, полученные результаты свидетельствуют о том, что нокдаун гена сиртуина-6 может влиять на синтез и деградацию коллагена [6]. Выявленное нами одновременное снижение синтеза коллагена I типа и сиртуина-6 при повышении экспрессии ММР-1 в фибробластах кожи человека при их старении в культуре полностью подтверждает это предположение. Выявленное нами снижение синтеза сиртуина-6 в фибробластах кожи при их старении в культуре может указывать на общебиологические процессы старения клеток кожи и снижение стабильности генома фибробластов. Выводы. Установлено, что при старении фибробластов кожи человека в культуре в них снижается экспрессия коллагена I типа и сиртуина-6, и одновременно возрастает экспрессия ММР-1. Вероятно, эти процессы тесно связаны между собой. Таким образом, выявленный нами паттерн изменения экспрессии коллагена I типа, сиртуина-6 и ММР-1 может характеризовать процессы старения фибробластов кожи. Поскольку результаты были получены нами на первичной культуре фибробластов кожи одного человека, в дальнейшем планируется получение аналогичных культур от других пациентов с целью уточнения представленных данных. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: И. М. К., В. Х. Х. Сбор и обработка материала: Н. В. Ф., А. О. Д. Статистическая обработка данных: А. В. Д. Анализ и интерпретация данных: С. В. Т., В. О. П. Написание текста: Н. С. Л. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

N. V. Fridman

St. Petersburg Bioregulation and Gerontology Institute

Email: ibg@gerontology.ru
Department of Biogerontology, Department of Cell Biology and Pathology

N. S. Lin’kova

St. Petersburg Bioregulation and Gerontology Institute; Peter the Great St. Petersburg Polytechnic University

Email: miayy@yandex.ru
Department of Biogerontology, Department of Cell Biology and Pathology; Department of Medical Physics; Institute of Physics, Nanotechnology and Telecommunications

V. O. Polyakova

D. O. Ott Scientific-Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproduction; St. Petersburg State University

Email: vopol@yandex.ru
Department of Pathomorphology; Departments of Pathology and Physiology

A. O. Drobintseva

D. O. Ott Scientific-Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproduction; St Petersburg State Pediatric Medical University

Email: anna-flor@mail.ru
Department of Pathomorphology; Department of Medical Biology

S. V. Trofimova

St. Petersburg Bioregulation and Gerontology Institute

Email: dr.s.trofimova@gmail.com
Department of Biogerontology, Department of Cell Biology and Pathology

A. V. Dudkov

St. Petersburg Bioregulation and Gerontology Institute

Department of Biogerontology

V. Kh. Khavinson

St. Petersburg Bioregulation and Gerontology Institute; RAS I. P. Pavlov Institute of Physiology

Department of Biogerontology; Group of Peptide Regulation of Ageing

I. M. Kvetnoy

St. Petersburg Bioregulation and Gerontology Institute; D. O. Ott Scientific-Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproduction; St. Petersburg State University

Department of Biogerontology; Department of Pathomorphology; Departments of Pathology and Physiology

References

Supplementary files