METHODS OF ARTICULAR CARTILAGE SAMPLE PREPARATION FOR EVALUATION OF ITS HISTOLOGICAL STRUCTURE, TINCTORIAL PROPERTIES AND ELEMENT COMPOSITION

Full Text

Хрящевые ткани характеризуются обилием межклеточного матрикса при относительно небольшой объемной доле клеточных компонентов [6]. Деструкция суставного хряща при остеоартрозе является каскадным процессом, в котором принимают участие и клетки, и внеклеточные компоненты, в первую очередь сульфатированные гликозаминогликаны. Они входят в состав протеогликанов и играют основную роль в поддержании гомеостаза, обеспечивают прочность ткани, архитектонику, митогенную активность, рецепторную функцию клеток и межклеточные взаимодействия [1]. Содержание сульфатированных гликозаминогликанов в образцах хряща можно оценивать по результатам рентгеновского электронно-зондового микроанализа серы [9]. Развивающаяся при остеоартрозе дистрофия межклеточного матрикса хряща сопровождается накоплением солей извести [13] и, как следствие, появлением базофилии. Методически представляется интересной возможность сопоставления гистологического исследования с методом рентгеновского электронно-зондового микроанализа суставного хряща. Исследования элементного состава суставного хряща при хондропатиях с использованием рентгеновского электроннозондового анализа единичны [5, 14]. Цель настоящего исследования - разработать оптимальные приёмы подготовки образцов суставного гиалинового хряща для сопоставительного анализа изменений его гистоструктуры и элементного состава при индуцированном остеоартрозе. Исследование выполнено на беспородных собаках обоего пола в возрасте 1,5-2 года. Исследовали суставной хрящ мыщелков бедренной кости 5 интактных (контроль) и 5 подопытных собак, которым моделировали остеоартроз по разработанному нами способу [2] путём редукции кровоснабжения и иммобилизации коленного сустава, через 28 сут иммобилизации животных выводили из опыта. Результаты морфологического исследования свидетельствуют, что разработанная экспериментальная модель остеоартроза (степень I-III по гистологической классификации Международного общества изучения остеоартроза OARSI) клинически релевантна и пригодна для доклинических испытаний различных терапевтических стратегий остеоартроза [5, 10]. Содержание животных, оперативные вмешательства и эвтаназию передозировкой барбитуратов проводили в соответствии с требованиями Министерства здравоохранения Российской Федерации к работе экспериментальнобиологических клиник (приказ МЗ СССР № 755, 1977 г.). Манипуляции, проводимые на животных, рассмотрены и одобрены этическим комитетом «РНЦ „ВТО” им. акад. Г. А. Илизарова» [протокол заседания этического комитета № 6 (42) от 02.12.2014 г.]. После вскрытия коленных суставов с мыщелков бедренной кости перпендикулярно суставной поверхности с помощью скальпеля вырезали образцы суставного хряща размером 2-3 × 5-6 мм, фиксировали их в альдегидном фиксаторе, исключая этап постфиксации тетраоксидом осмия, так как рентгеновские пики тяжелых металлов могут маскироваться или налагаться на излучение интересуемых элементов [3, 9]. Учитывая, что суставной хрящ содержит большое количество воды - 80% массы [6], материал дегидратировали в режиме плавного перехода от спирта к ацетону в соответствии с методами [7], но с увеличением времени на этапах от 70 до 96% спирта до 1 ч. Этапы пропитки и заливки в смолу (аралдит) проводили по разработанному нами ранее способу [4]. Увеличенная плотность матрикса суставного хряща за счет заливочной среды (аралдита) по сравнению с незалитым материалом уменьшает объем возбуждения рентгеновского излучения, что ведет к повышению чувствительности микроанализа. Дальнейшее исследование состояло из двух этапов. На первом этапе из полученных эпоксидных блоков с помощью ультратома «Nova» (LKB, Швеция) изготавливали полутонкие срезы, которые окрашивали метиленовым синим (метахроматическая реакция на сульфатированные гликозаминогликаны) и метиленовым синим-основным фуксином (для выявления базофилии). Препараты исследовали на фотомикроскопе «Opton-3» (Оpton, Германия). На втором этапе поверхности эпоксидных блоков после изготовления полутонких срезов исследовали методом рентгеновского электроннозондового микроанализа. Использование эпоксидных блоков после изготовления полутонких срезов позволяет исключить этапы шлифовки и полировки, что существенно сокращает время подготовки образца и исключает артефакты. Для исследования от каждого животного случайным образом отбирали по 3 блока. С помощью токопроводящего клея образцы закрепляли на хорошо отполированные чистые алюминиевые диски. Поверхности эпоксидных блоков напыляли серебром в вакуумном напылителе «JEE-4 Х/5В» (Eiko, Япония) и ионном напылителе «IB-6» (Eiko, Япония). Исследования проводили на рентгеновском электронно-зондовом микроанализаторе «INСA Energy 200» (Oxford Instrumets Analytical, Англия), смонтированном на сканирующем электронном микроскопе «JSM-840» (Jeol, Япония), при ускоряющем напряжении 20 кэВ. Результаты исследований получали в виде элементных карт - Smart Map и данных количественного элементного анализа в весовых процентах (вес.%). Определяли распределение и содержание серы (ωS, вес.%), кальция (ωСа, вес.%) и фосфора (ωP, вес.%) в поверхностной, промежуточной и глубокой зонах суставного хряща и кальцифицированном хряще. С целью получения однотипных, стандартных результатов проводили калибровку прибора по образцу - эталону волластонита (СаО : SiO2). Для сбора рентгеновских спектров использовали два режима оперирования: режим сканирования по линии и сканирующий режим площади, для второго случая - систематическое сканирование полей рядами, ориентированными строго по длиннику поверхности объекта, обеспечивало получение наиболее репрезентативной выборки. При этом важно надежно исключить взаимоперекрытие тестовых полей, выборку формировали тотально. Для анализа цифрового материала использовали описательную статистику. Значимость различий оценивали с помощью критерия Вилкоксона в программе AtteStat 1.0 в электронных таблицах Microsoft Excel 97. Различия считали значимыми при p<0,05. При окраске метиленовым синим на полутонких срезах суставного хряща интактных животных отмечены умеренная реакция метахромазии в межтерриториальном матриксе поверхностной зоны и интенсивная метахромазия территориального матрикса промежуточной и глубокой зон (рис. 1, а). Электронно-зондовый микроанализ в режиме сканирования по линии подтвердил неравномерное распределение серы по зонам суставного хряща интактных животных (см. рис. 1, б, в). Количественный анализ показал, что содержание серы, как и реакция метахромазии, увеличивалось от поверхностной к глубокой зоне: в поверхностной зоне - 0,350±0,010 вес.%, в промежуточной - 0,42±0,04 вес.%, в глубокой - 0,520±0,020 вес.%. Выявлены следы кальция в поверхностной зоне хряща (ωСа было меньше 0,02 или 0,01 вес.%), в промежуточной зоне ωСа составило 0,040±0,010 вес.%, в глубокой зоне ωСа - 0,090±0,010 вес.%. Содержание фосфора во всех зонах суставного хряща меньше 0,02 или 0,01 вес.%. В кальцифицированном хряще содержание кальция, фосфора и серы составило 13,93±0,02, 6,890±0,010 и 0,140±0,020 вес.% соответственно, отношение Са:Р равнялось 2,02. При индуцированном остеоартрозе реакция метахромазии имела очаговый характер, значительно снижена ее интенсивность, отмечено разволокнение межклеточного вещества поверхностной зоны. Рентгеновский электроннозондовый микроанализ выявил относительно интактной нормы достоверное (р<0,05) снижение ωS во всех зонах хряща (в поверхностной зоне - 0,18±0,04 вес.%, в промежуточной - 0,230±0,020 вес.%, в глубокой - 0,28±0,03 вес.%). При окраске метиленовым синим-основным фуксином отмечали интенсивную базофилию матрикса промежуточной и глубокой зон, истончение или полное отсутствие в отдельных участках зоны кальцифицированного хряща (рис. 2, а). На границе кальцифицированного хряща с субхондральной костью отмечены явления остеокластической резорбции (см. рис. 2, б). Зарегистрировано появление кальция в поверхностной зоне (ωСа - 0,04±0,02 вес.%); и значительное (р<0,05) его увеличение в промежуточной (ωСа - 0,080±0,020 вес.%) и глубокой (ωСа - 0,150±0,020 вес.%) зонах относительно нормы. Содержание фосфора в поверхностной зоне было меньше 0,02 вес.%, в промежуточной и глубокой зонах ωP составило 0,030±0,010 и 0,080±0,010 вес.% соответственно. В кальцифицированном хряще содержание кальция и фосфора значимо (р<0,05) снижено по сравнению с интактной нормой (ωСа - 9,72±0,03 вес.%, ωP - 4,740±0,020 вес.%), отношение Са:Р равнялось 2,05. Smart Map (см. рис. 2, в) демонстрирует снижение ωСа в кальцифицированном хряще. Значения ωS незначительно снижались - 0,130±0,020 вес.%. Рентгеновский электронно-зондовый микроанализ выявил неравномерное распределение серы в суставном хряще интактных животных, ωS увеличивалось от поверхностной к глубокой зоне, данная закономерность распределения серы сохранялась и в суставном хряще при индуцированном остеоартрозе. Полученные данные согласуются с данными литературы, содержание агрекана в поверхностной зоне хряща ниже, чем в других зонах [12]. Известно, что метаболизм сульфатированных гликозаминогликанов изменяется уже на самых ранних этапах повреждения суставного хряща [6]. Результаты микроанализа показали, что в суставном хряще экспериментальных животных происходит потеря серы во всех зонах хряща, но в наибольшей степени в промежуточной и глубокой зонах, что сопровождается увеличением в большей степени в этих зонах кальция и появлением фосфора. В проведенных нами ранее исследованиях показано, что при моделировании остеоартроза наиболее уязвимыми являются хондроциты промежуточной зоны, более 50% клеток в состоянии деструкции, многие с признаками апоптоза [5, 10]. Известно, что образуемые хондроцитами апоптотические тела содержат щелочную фосфатазу, преципитируют кальций, что способствует кальцификации хряща [11]. Установлено, что при остеоартрозе гипертрофированные хондроциты глубокой зоны продуцируют в избытке коллаген X типа, матриксную металлопротеиназу-13 и щелочную фосфатазу, которые влияют на процесс кальцификации [8]. В кальцифицированном хряще при индуцированном остеоартрозе зарегистрировано снижение в одинаковой степени ωСа и ωP, отмечены признаки остеокластической резорбции, выявлены участки, в которых кальцифицированный хрящ отсутствовал. Таким образом, подготовка биологических объектов для рентгеновского микроанализа осуществляется по тем же принципам, что и подготовка для электронной микроскопии, но имеет свою специфику, необходимо учитывать и особенности исследуемых объектов. Приведенные результаты исследования однозначно демонстрируют возможности примененного рентгеновского электронно-зондового микроанализа в изучении молекулярных механизмов изменения тинкториальных свойств суставного хряща при индуцированном остеоартрозе, эти изменения зарегистрированы и количественно оценены. Автор сообщает об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

T. A. Stupina

Russian G. A. Ilizarov Scientific Centre for Restorative Traumatology and Orthopedics

Email: StupinaSTA@mail.ru
Laboratory of Morphology

References

Supplementary files