COMPENSATORY CHANGES OF GOLDFISH MAUTHNER NEURONS INDUCED BY SENSORY STIMULATION AND BETA-AMYLOID APPLICATION

Full Text

Известно, что нейрональная дисфункция при старении и некоторых заболеваниях мозга связана с постсинаптической стороной синапса - дендритом [2]. В этих отростках центральных нейронов происходят ключевые изменения при болезни Альцгеймера и у трансгенных животных, продуцирующих мутантный человеческий белок-предшественник бета-амилоида, являющегося патофизиологическим фактором болезни. На больших массивах данных о трансформации нейронов гиппокампа и других отделов коры больших полушарий выявлены сдвиги в траектории дендритов, а также изменение их диаметра и утрата синапсов [3, 6, 11]. Подобные видоизмененные дендриты существуют наряду с вполне нормальными отростками, но при их множестве трудно установить для каждого нейрона, какие именно отростки деформированы, а какие остались неповрежденными, каким образом это связано с функцией нейрона. Судьбу конкретных дендритов в эксперименте можно проследить при проведении исследований на идентифицированных маутнеровских нейронах (МН) ретикулярной формации костистых рыб. У каждой особи имеются только два таких нейрона. Каждый из них имеет только латеральный дендрит (ЛД) и вентральный дендрит (ВД), принимающие сигналы, соответственно, от статоакустического и зрительного аппарата [5]. На этих модельных объектах ранее нами было показано, что в результате аппликации фрагмента 25-35 бета-амилоида (далее - Аβ25-35) и последующей зрительной стимуляции золотой рыбки деструкция ВД сопровождалась появлением нового, медиального дендрита (МД) [4], феномен образования которого нуждается в детальном рассмотрении. Цель настоящей работы - сравнительное изучение строения ВД и МД парных МН, а также их синапсов в условиях аппликации на нейроны Аβ25-35 и повышенной функциональной нагрузки (длительной вестибулярной и зрительной стимуляции), влияющей на афферентные входы к этим нейронам. Материал и методы. Исследование проведено на аутопсийном материале 13 мальков золотой рыбки (Carassius auratus L.) породы «Оранда» массой около 2 г. Эксперименты проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». На проведение данного исследования получено разрешение комиссии ИТЭБ РАН по биологической безопасности и биоэтике (№ 2 от 20.04.2017 г.). Аппликацию Аβ25-35 (Sigma, США) в область расположения МН и сенсорные стимуляции выполняли как описано ранее [4, 10]. Вестибулярной стимуляции подвергали 7 особей спустя 24 ч после аппликации, зрительной стимуляции - 6 особей спустя 17 ч после аппликации. Различия в функциональной активности между правым и левым МН рыбки оценивали косвенно по коэффициенту моторной асимметрии (КМА), позволяющему определить, какой из двух нейронов функционально более активный (доминантный) [7]. При этом учитывали, что МН образуют двухклеточный командный центр, инициирующий левым нейроном направление поворота рыбки вправо, а правым нейроном - влево [5, 7]. После экспериментального воздействия рыбок ненадолго погружали в ледяную воду, затем декапитировали на льду и извлекали содержащий МН участок продолговатого мозга для микроскопических исследований по методике, принятой в лаборатории [1]. На пирамитоме LKB (LKB, Швеция) готовили серийные поперечные срезы толщиной 3 мкм, по которым выполняли 3D-реконструкцию с формированием виртуальных изображений МН, дополненных величинами объемов [1]. По целостным объемам нейронов вычисляли коэффициент структурной асимметрии (КСА) для установления соответствия между величинами КМА и КСА [7]. Интегральное микроскопическое строение МН изучали по компьютерным монтажам выбранных 40 панорамных изображений срезов. Для изучения ультраструктуры МН с переклеенных на столбики из эпона (Fluka AG, Швейцария) гистологических срезов на ультрамикротоме «Leica EM UC6» (Leica, ФРГ) готовили ультратонкие срезы, их изучали в электронном микроскопе «Tesla BS-500» (Tesla, Чехословакия) при увеличении 14 000. Сравнительный анализ структуры синапсов проводили по группам согласно принятым морфологическим критериям [8, 10]. Измерения специализированных контактов выполняли интерактивно на оцифрованных негативах с помощью разработанной А. А. Деевым (ИТЭБ РАН) программы морфометрического анализа изображений «Plana». Математическую обработку данных проводили, используя программу Microsoft Office Excel 2003. О значимости различий судили по величине t-критерия Стьюдента и считали их значимыми при р<0,05. Для определения значимых различий при малых выборках применяли критерий Манна-Уитни. Результаты исследования. Изучение асимметрии латерального поведения показало, что значение КМА до и после аппликации с последующей вестибулярной стимуляцией не изменилось, и доминантный нейрон остался прежним. При аппликации и зрительной стимуляции значения КМА до и после воздействий составили 0,57±0,03 и 0,38±0,09 соответственно (р<0,05), что указывает на смену функционального доминирования МН. В каждой группе рыбок только у 4 особей были обнаружены МД. Их сформировали те нейроны, ВД которых оказались существенно редуцированными (табл. 1). Исследованные МД также имели меньшие величины объемов, чем ВД интактных МН, что подтверждалось и при рассмотрении строения и объемных характеристик индивидуальных нейронов рыбок с одинаковой моторной латерализацией (рис. 1, табл. 2). Строение индивидуальных МН подопытных золотых рыбок в корне отличалось от МН интактной золотой рыбки (см. рис. 1, а). После аппликации Аβ25-35 и вестибулярной стимуляции оба МН находились в состоянии дегенерации (см. рис. 1, б). Цитоплазма нейронов темная, они небольшие по размеру, их ВД исчезающе малы, обнаруженный МД тоже имел маленький объем. Функциональная оценка МН по КМА свидетельствует о некотором снижении активности правого нейрона, поврежденного сильнее, и по результатам измерений имеющего меньший объем по сравнению с субдоминантным нейроном. По КСА наблюдается структурная инверсия МН. После аппликации и зрительной стимуляции объем правого нейрона более чем в 3 раза превышал объем сильно деформированного левого нейрона. Цитоплазма обоих МН просветлялась. Редукция ВД сопровождалась формированием МД у обоих МН. Существенно, что вследствие экспериментального воздействия происходила инверсия латерализации золотой рыбки (см. табл. 2), совпадающая с инверсией объемов МН, и таким образом, доминантным становился левый нейрон. Данные электронно-микроскопического анализа в целом соответствовали исследованиям светового уровня, показавшим, что в каждой паре клеток доминантный МН в большей степени был подвержен деструкции. Так, при действии Аβ25-35 и вестибулярной стимуляции в осмиофильной цитоплазме правого ВД доминантного нейрона с трудом идентифицировались отдельные элементы цитоскелета (рис. 2, а). Повсеместно встречались ячеистые включения и миелиновые фигуры. В округлых субсинаптических митохондриях кристы заполняли периферию органелл, их центральная часть включала осмиофильное образование, вакуоль и реже - миелиновую структуру. В ВД левой, субдоминантной клетки (см. рис. 2, б), образующей МД, нейрофиламенты уже можно было идентифицировать, ячеистые структуры отсутствовали, однако часть митохондрий имела аномальное строение, описанное выше. В МД протяженные нейрофиламенты находились на определенном расстоянии друг от друга и сохраняли параллельное расположение по ходу дендрита. Видны цистерны поперечного и продольного эндоплазматического ретикулума (см. рис. 2, в), характерные для ВД интактного нейрона. Митохондрии в постсинаптической части также деформированы, но в синаптических бутонах они сохраняли нормальное строение. В синаптическом аппарате дендритов преобладали химические синапсы типа 1 с активной зоной на гребешке (см. рис. 2, а-в). В существенно меньшем количестве представлены химические синапсы типа 2 и электрические синапсы (тип 3). Все виды синаптических контактов имели хорошую сохранность. Признаки дегенерации касались синаптических окончаний, локализованных на дендритах обеих клеток. Они проявлялись в опустошении бутонов и сосредоточении везикул преимущественно у активных зон. В свободном от везикул пространстве находились вакуоли или мембранные структуры. Кластеры опустошенных бутонов чередовались с кластерами бутонов со средним наполнением везикулами. Полностью заполненные бутоны встречались только в аксонных окончаниях, контактирующих с МД. После аппликации Аβ25- 35 и зрительной стимуляции ультраструктура ВД доминантного левого МН проявляла признаки глубокой деструкции (см. рис. 2, г). Контур плазматической мембраны местами не прослеживался. Цитоплазма выглядела обводненной. Цитоскелет практически не выявлялся. В дендроплазме обнаруживались набухшие митохондрии, но в аксонных окончаниях митохондрии сохраняли строение, близкое к интактному. Синаптические контакты определялись с трудом. Чаще встречались опустошенные синаптические бутоны, крайне редко - небольшие синапсы химического типа, заполненные везикулами. Плазматическая мембрана правой, субдоминантной клетки также местами теряла четкость контура (см. рис. 2, д). В осмиофильной цитоплазме ВД параллельное расположение нейрофиламентов не нарушалось. У МД в проксимальной его части дендроплазма достаточно рыхлая. Митохондрии в обоих дендритах правого нейрона слегка набухшие, в центре могли встречаться мембранные образования. Специализированные контакты идентифицировались не всегда четко. При этом синапсы на ВД были опустошены, а синапсы на МД заполнены синаптическими везикулами, склеенными в небольшие группки (см. рис. 2, е). Результаты морфометрических измерений описанных выше нейронов приведены ниже (табл. 3). При аппликации Аβ25-35 и вестибулярной стимуляции размеры специализированных контактов синапсов, локализованных на правом МН, не имели значимых различий. У левого МН все контакты, образующие связи с МД (и частично с ВД), имели большую протяженность, чем такие же контакты с сомой нейрона. Сравнение контактов ВД и МД показало достоверное различие только в протяженности активной зоны синапсов типа 2 на МД: она возрастала примерно на 20 %, что может свидетельствовать о возросшей функциональной активности синапсов с химическим типом сигнализации. У обоих дендритов примерно на 40 % по сравнению с сомой увеличивалась протяженность десмосомоподобных контактов. При аппликации Аβ25-35 и оптокинетической стимуляции синаптические контакты левого МН определялись с трудом, что сделало невозможным оценку их протяженности. Анализ размеров специализаций ВД и МД правого нейрона показал, что активная зона в синапсах типа 1 на МД отличалась от активной зоны таких же синапсов на ВД. Ее протяженность несколько возрастала. Однако в синапсах типа 2 активные зоны ни на ВД, ни на МД не менялись, что, по-видимому, обусловлено патологией цитоскелета и связанной с ней редукцией актинсодержащих десмосомоподобных контактов примерно на 28 %. Обсуждение полученных данных. В работе были исследованы ВД и отходящие от сомы в вентромедиальном направлении МД, выявляемые только в условиях примененных воздействий. Подобные дендриты не обнаруживались при отдельных эффектах аппликации Аβ25-35 [4] и зрительной стимуляции [8] или при совместном влиянии Аβ25-35 и адаптирующей вестибулярной стимуляции [10]. Существование новых дендритов, впервые показанное у МН, рассматривается нами как компенсаторная реакция на нейротоксическое действие Аβ25-35 и предельную физиологическую нагрузку, следствием которых является значительное сокращение объемов нейронов и дендритов, повреждение их ультраструктуры и деструкция синапсов. Дегенерация более активных нейронов проявляется в большей степени, чем менее активных, имеющих больший объем и в своем составе - МД, что приводит к несоответствию значений КМА и КСА. О существующей связи между патологическими изменениями строения дендритов и дисфункцией нейрона сообщается в совместных электрофизиологических исследованиях и компьютерном моделировании нейронов гиппокампа на трансгенных мышиных моделях болезни Альцгеймера. Как выяснилось, для резко выраженного изменения фундаментальных электрических свойств нейрона достаточно уменьшения величины дендритов, в геометрии которых, вероятно, заложен важный патологический механизм нейродегенерации [9]. Одинаковые размерные характеристики специализированных контактов в морфологически однотипных синапсах, локализованных на ВД и МД, указывают на то, что благодаря МД увеличивается воспринимающая поверхность нейрона для обеспечения его функционирования на требуемом уровне при сильной дистрофии ВД и дисфункции его синапсов. В целом, феномен образования МД свидетельствует о сохранении у центральных нейронов мальков золотой рыбки пластических свойств, выявляемых на уровне формирования дополнительных отростков. Результаты нашей работы, проведенной на идентифицированных нейронах, имеющих индивидуальные дендриты, позволяют предположить, что и у других моделей возможно образование новых клеточных отростков в экспериментальных условиях, тесно связанных с деструкцией существующих дендритов. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Н. Р. Т., Н. А. П. Сбор и обработка материала: Н. А. П., Г. З. М., И. Б. М., Н. Р. Т., Е. Н. Б. Статистическая обработка данных: Г. З. М., Н. А. П., Н. Р. Т. Анализ и интерпретация данных: Н. Р. Т., Г. З. М. Написание текста: Н. Р. Т. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

N. R. Tiras

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics; Pushchino State Institute of Natural Sciences

Email: ntiras@rambler.ru
Laboratory of Experimental Neurobiology; Faculty of Biophysics and Biomedicine 3 Institutskaya Str., Pushchino, Moscow Region 142290; 3 Prospect Nauki, Pushchino, Moscow Region 142290

I. B. Mikheyeva

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Laboratory of Experimental Neurobiology 3 Institutskaya Str., Pushchino, Moscow Region 142290

G. Z. Mikhailova

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Laboratory of Experimental Neurobiology 3 Institutskaya Str., Pushchino, Moscow Region 142290

N. A. Pen’kova

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Laboratory of Experimental Neurobiology 3 Institutskaya Str., Pushchino, Moscow Region 142290

Ye. N. Bezgina

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Laboratory of Experimental Neurobiology 3 Institutskaya Str., Pushchino, Moscow Region 142290

References

Supplementary files