MORPHOMETRIC AND CYTOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF THE DUODENAL EPITHELIOCYTES IN 10- AND 45 DAYSOLD OFFSPRING OF RATS DEVELOPING UNDER CONDITIONS OF ANTENATAL ALCOHOLIZATION

Full Text

Проблема антенатального воздействия на потомство потребления алкоголя женщинами детородного возраста представляется важной и актуальной. При этом имеет значение не только число рождаемых детей, но и их качество жизни. Известно, что при пренатальной алкогольной интоксикации имеют место задержка роста, характерные изменения в нервной, эндокринной [13, 15, 16], сердечно-сосудистой [14], дыхательной [10], мочевой и половой [8] системах. Наблюдаются нарушения органов кроветворения и чувств [5, 9]. Употребление матерями во время беременности алкоголя вызывает у потомства повреждения желудочно-кишечного тракта. Известно, что в двенадцатиперстной кишке происходят активация пищеварительных ферментов, интенсивный гидролиз белков, жиров, углеводов, всасывание эпителиоцитами ворсинок и крипт продуктов гидролиза. Помимо этого, двенадцатиперстная кишка обладает важной функцией координатора моторной деятельности проксимальных и дистальных отделов пищеварительной трубки, экзокринной функции поджелудочной железы, желчеобразования и желчевыделения [1]. Учитывая важность данного отдела тонкой кишки в жизнедеятельности организма, нами была поставлена цель - выявить морфологические и цитохимические особенности эпителиоцитов ворсинок и крипт двенадцатиперстной кишки у 10-и 45-суточного потомства крыс, развивавшегося в условиях антенатальной алкоголизации. Материал и методы. Исследование проведено на 32 крысах 10-и 45-суточного возраста с соблюдением требований, изложенных в Хельсинкской декларации о гуманном обращении с животными. На данное исследование получено разрешение комитета по биомедицинской этике Гродненского государственного медицинского университета (№ 1, от 05.01.2015 г.). Подопытными животными были 16 крыс, полученных от матерей, которые на протяжении всей беременности употребляли в качестве единственного источника питья 15 % раствор этанола. Среднее потребление алкоголя беременными самками составляло 4 г/(кг • сут). В качестве контроля использовали 16 крыс, рождённых от матерей, которые во время беременности употребляли эквиобъемное количество воды. Все самки контрольных и опытных групп и родившееся от них потомство содержались в одинаковых условиях вивария. Крыс контрольных и опытных групп по достижению ими 10-и 45-суточного возраста выводили из опыта лёгким эфирным наркозом с последующей декапитацией и забором после тщательного осмотра начальной части двенадцатиперстной кишки. Одни кусочки взятого материала фиксировали в жидкости Карнуа, охлаждённом ацетоне и заключали в парафин по принципу «контроль-опыт». Изготовленные на микротоме Leica RM 2135 (Германия) парафиновые срезы толщиной 5 мкм после окраски гематоксилином - эозином использовали для гистологических и морфометрических исследований. На срезах толщиной 10 мкм в эпителиоцитах определяли содержание гликопротеинов по Шабадашу, сиаломуцинов по Spicer, рибонуклеопротеинов (РНП) по Эйнарсону и щелочной фосфатазы по Гомори [12]. Другие кусочки подвергали глубокому замораживанию в жидком азоте. В срезах толщиной 10 мкм, изготовленных в криостате фирмы Leica CM 1850 (Leica Microsystems GmbH, Германия) при температуре -15 ºС, определяли в эпителиоцитах слизистой оболочки локализацию и активность дегидрогеназ: сукцината (СДГ; сукцинат: акцептор-оксидоредуктаза; КФ 1.3.99.1 по Нахласу и др., 1957), лактата (ЛДГ; L-лактат: НАДоксидоредуктаза; КФ 1.1.1.27; по Гесс и др., 1958) и восстановленного НАДН (НАДН-ДГ; акцептор-оксидоредуктаза: КФ 1.6.93.3 по Нахласу и др., 1958). Все гистохимические реакции сопровождались бессубстратными контролями [2]. Содержание в бокаловидных клетках гликопротеинов, сиаломуцинов и активность в щёточной каёмке эпителиоцитов щелочной фосфатазы оценивали визуально, а РНП, как и активность оксидоредуктаз, - цитофотометрически. Изучение гистологических препаратов с последующим морфо-и цитофотометрическим анализом осуществляли с использованием микроскопа Axioskop 2 plus (Carl Zeiss, Германия), оснащённого цифровой камерой Leica DFC 320 (Leica, Германия). Для морфо-и цитофотометрической обработки использовали программу Image Warp (Bit Flow, США). Полученные цифровые данные обрабатывали методами непараметрической статистики с помощью компьютерной программы Statistiсa 6.0 для Windows. При обработке данных о значимости различий судили по двустороннему непараметрическому U-критерию Манна-Уитни. Результаты считали значимыми при р<0,05. Данные представлены в виде Me (IQR), где Ме - медиана, а IQR - интерквартильный размах. Морфометрические показатели выражались в микрометрах (мкм), а цитофотометрические - в единицах относительной плотности (ед. опт. пл.). Результаты исследования. Исследованиями установлено, что пренатальная алкогольная интоксикация вызывает у родившегося потомства и достигшего 10-суточного возраста снижение высоты микроворсинчатых эпителиоцитов ворсинок двенадцатиперстной кишки на 14,71 % (р<0,05). Наблюдалась тенденция к уменьшению толщины их щёточной каёмки (таблица; рис. 1, а). При этом в цитоплазме эпителиоцитов имели место явления микро-и макровакуолизации, что приводило к снижению её тинкториальных свойств. Ядра эпителиоцитов сохраняли овальную форму, но имели меньшие размеры (достоверные уменьшения площади на 27,79 % и периметра на 15,56 %) по сравнению с контролем и часто располагались не на одном уровне. Нередко наблюдались инфильтрация лимфоцитами расширенных межклеточных пространств и увеличение просветов подэпителиальных кровеносных капилляров. Крипты у подопытных крыс в сравнении с контрольной группой имели вид неупорядоченно расположенных небольших углублений. Высота их эпителиоцитов была уменьшена на 25,47 %. Щёточная каёмка в эпителиоцитах крипт практически не просматривалась. Ядра имели округлую форму, плотно прилегали друг к другу. Как видно из таблицы, их площадь в сравнении с контролем была уменьшена на 27,27 %, а периметр - на 14,87 %. Ядра клеток Панета округлые, с неотчётливой структурой. Реже, чем в контроле, встречались бокаловидные и митотически делящиеся клетки. Активность ферментов в эпителиоцитах ворсинок и крипт изменялась неоднозначно: значимо уменьшалась активность СДГ, а НАДН.ДГ проявляла тенденцию к снижению, ЛДГ возрастала лишь в эпителиоцитах крипт, а КФ - в эпителиоцитах ворсинок (рис. 2). При этом продукты реакции становились крупноглыбчатыми, не всегда сохранялась полярность расположения, что приводило зачастую к нивелированию разницы в активности ферментов между апикальным и базальным отделами эпителиоцитов. Содержание гликопротеинов в бокаловидных клетках становилось меньше, мало их было и в поверхностном слое слизи. Было низким в бокаловидных клетках и содержание сиаломуцинов, но их количество в слизистых наложениях в нижней трети ворсинок возрастало. На 45-е сутки постнатального развития подопытных животных высота микроворсинчатых эпителиоцитов ворсинок продолжала быть сниженной на 15,45 % по сравнению с контролем. Их щёточная каёмка отличалась меньшей оксифилией и сниженной на 16,46 % толщиной (см. таблицу). Однако явления вакуолизации в цитоплазме эпителиоцитов встречались реже, нежели на предыдущем сроке. Ядра по сравнению с 10-суточными животными приобретали овальную форму и располагались преимущественно ближе к базальному полюсу, но продолжали быть меньшего размера. Их площадь была меньше на 19,11 %, а периметр - на 14,33 % по сравнению с контролем. Несмотря на это, структура ядер просматривалась чётко: хроматин был в виде мелких глыбок, 1-2 ядрышка занимали как центральное, так и эксцентричное положение в кариоплазме. В межклеточных пространствах у базального полюса эпителиоцитов встречались лимфоциты. Среди эпителиоцитов заметно возрастало число бокаловидных клеток, апикальный полюс которых местами был переполнен секретом. Крипты удлинялись и приобретали вид длинных компактно расположенных трубочек. В межкриптной строме местами встречались расширенные гемокапилляры. Размер ядер эпителиоцитов был снижен по сравнению с контролем: площадь - на 20,25 %, периметр - на 11,94 % (см. таблицу). При этом надо отметить, что структура ядер просматривалась чётко. Чаще, как и среди эпителиоцитов ворсинок, встречались бокаловидные клетки, апикальные полюса которых нередко переполнялись секреторными гранулами. Среди микроворсинчатых эпителиоцитов крипт встречались митотически делящиеся клетки. Клетки Панета располагались в области донышек крипт в виде клеточного конгломерата. Апикальные полюса клеток ввиду обильной вакуолизации приобретали пенистый вид. В эпителиоцитах ворсинок цитофотометрически установлено значимое уменьшение активности СДГ и НАДН-ДГ и возрастание КФ (см. рис. 1, в, д; рис. 3). Однако характер и полярность распределения продуктов реакции не отличались от таковых в контроле. Гликопротеины и сиаломуцины в большом количестве выявлялись в бокаловидных клетках, расположенных в верхней трети крипт, а в бокаловидных клетках ворсинок их содержание было меньшим. Данные биополимеры в обилии выявлялись в поверхностной слизи, что говорит об интенсивной фазе их экструзии. Сульфомуцины в небольшом количестве в основном определялись в бокаловидных клетках крипт и поверхностном слое слизи, покрывающей ворсинки. Помимо этого, они обнаруживались в гранулах тучных клеток, обильно встречаемых в строме слизистой оболочки вблизи гемокапилляров. Обсуждение полученных данных. В результате эксперимента было установлено, что введение беременным крысам 15 % раствора этанола из расчёта 4 г/(кг·сут), приводит к развитию морфологических и цитохимических изменений в микроворсинчатых эпителиоцитах ворсинок и крипт у их потомства. Можно полагать, что ведущую роль в возникновении выявленных изменений сыграло токсическое воздействие самого алкоголя и его метаболитов, особенно ацетальдегида [12]. Они свободно проникают через гематоплацентарный барьер и оказывают повреждающее действие [7]. Наиболее выраженный эмбриотоксический эффект этанол и особенно ацетальдегид дают в период интенсивного деления клеток плода. В этой связи наиболее опасным периодом беременности в плане возникновения повреждений развивающегося организма является I триместр, когда происходит процесс органогенеза зародыша, и его клетки наиболее уязвимы к действию повреждающих факторов [11]. Токсическое воздействие алкоголя в первые 3 нед беременности приводит к «клеточной смерти», сопровождающейся грубыми пороками развития внутренних органов плода и часто является причиной его внутриутробной гибели [4]. В нашем исследовании было установлено снижение высоты микроворсинчатого эпителия слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, размеров его ядер, наличие цитохимических изменений в цитоплазме эпителиоцитов. Эти изменения могут стать причиной функциональных нарушений в тонкой кишке крыс [6], уменьшении её массы, длины и моторики у антенатально алкоголизированных животных [3, 6], что имеет отдаленные негативные последствия для всего организма. Таким образом, антенатальная алкоголизация вызывает выраженные гистологические и цитохимические изменения в микроворсинчатых эпителиоцитах ворсинок и крипт двенадцатиперстной кишки, которые, вероятно, могут остаться и на более поздних сроках постнатального развития. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Я. Р. М. Сбор и обработка материала: Ю. Н. В. Статистическая обработка данных: Ю. Н. В. Анализ и интерпретациz данных: Ю. Н. В., Я. Р. М. Написание текста: Ю. Н. В. Редактирование: Я. Р. М. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

Yu. N. Voronik

Grodno State Medical University

Email: Julia_nikol@mail.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology 80 Gorkiy Str., Grodno, 230015 Belarus

Ya. R. Matsyuk

Grodno State Medical University

Email: matsiuk39@mail.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology 80 Gorkiy Str., Grodno, 230015 Belarus

References

Supplementary files