MORPHOLOGICAL RESTRUCTURING OF KIDNEYS IN RATS WITH ALLOXAN DIABETES SUBJECTED TO STIMULATION OF MACROPHAGE FUNCTIONAL ACTIVITY

Full Text

Одним из хронических осложнений сахарного диабета (СД) является диабетическая нефропатия (ДН), основу формирования которой составляет микроангиопатия сосудов почек [4]. В сосудистом клубочке происходят структурные изменения в виде очагового утолщения базальных мембран капилляров, что приводит к нарушению проницаемости сосудистой стенки и развитию стромального отека, расширению мочевого пространства. [4, 11]. Развивающаяся тканевая гипоксия является причиной деструкции мезангиальных клеток и развития гломерулосклероза. По современным представлениям, макрофаги интерстициальной почечной ткани являются клетками, с одной стороны, влияющими на развитие воспаления при повреждении почечной ткани, а с другой стороны, определяют интенсивность восстановительных процессов при травме и заболеваниях почек. Поражение почек и их репарация представляют собой хрупкий баланс между гибелью клеток, их пролиферацией и макрофаг-зависимым образованием экстрацеллюлярного матрикса [5, 12]. Цель настоящего исследования - оценить изменения структурной организации почки у крыс с аллоксановым СД при модуляции функциональной активности макрофагов. Материал и методы. Эксперимент выполнен на 42 крысах-самцах линии Вистар массой 210,0±5,6 г. Содержание животных и все манипуляции соответствовали Директиве Совета ЕС 2010/63/EU. Получено заключение этического комитета Института иммунологии и физиологии УрО РАН (протокол № 3 от 01.09.2016 г.; протокол № 5 от 14.08.2017 г.). В работе применялась разработанная нами ранее модификация экспериментальной модели СД 1-го типа с внутрибрюшинным введением раствора аллоксана в 0,85 % растворе хлорида натрия из расчета 300 мг/кг [7, 8]. Стимуляцию активности макрофагов осуществляли после 30 сут развития СД посредством внутримышечных инъекций 3-аминофталгидразида (АФГ) в дистиллированной воде из расчета 2 мг/кг массы по схеме. В качестве стимулятора активности макрофагов был использован аминофталгидразид (АФГ) - вещество, способное ингибировать продукцию макрофагами провоспалительных цитокинов и активных форм кислорода и увеличивать выработку комплекса факторов роста [9, 10]. Были сформированы 6 групп животных по 7 крыс в каждой: 1-я - интактные крысы; 2-я - СД 30 сут; 3-я - СД 60 сут; 4-я - СД+АФГ; 5-я - здоровые животные, получавшие внутрибрюшинно 0,85 % раствор хлорида натрия в объеме, равном объему аллоксана; 6-я - крысы с аллоксановым диабетом, получавшие внутримышечные инъекции дистиллированной воды соответственно объему и числу инъекций раствора АФГ. 5-я группа служила контролем для 2-й и 3-й групп, для 4-й группы контролем была 6-я группа. 5-я и 6-я группы были исследованы для выявления влияния внутрибрюшинных инъекций на здоровых крыс и внутримышечных инъекций на диабетических крыс. Животных выводили из эксперимента через 30 и 60 сут передозировкой диэтилового эфира. В плазме крови у крыс при помощи глюкозоксидазной методики определяли уровень глюкозы, а также выявляли содержание мочевины, креатинина при помощи стандартных наборов реактивов фирмы «Витал Диагностикс» (Санкт-Петербург). Уровень инсулина в плазме крови определяли иммуноферментным методом стандартным набором ELISA Rat assay (Insulin ELISA, Mercodia AB, Switzerland) на автоматическом анализаторе «Lazurite automated Elisa system». В цельной крови изучали содержание гликированного гемоглобина с применением аффинной гель-хроматографии и набора реактивов «Диабет-тест» фирмы ФОСФОСОРБ (Москва); использовали спектрофотометр DU 800 (Beckman Coulter Int. S. A., Switzerland). Почки у экспериментальных животных фиксировали в 10 % нейтральном формалине 24 ч при комнатной температуре. Подготовку образцов для гистологического исследования осуществляли с использованием автоматического процессора Leica EG 1160 с последующей заливкой в парафин. Первый срез из серии толщиной 3-4 мкм окрашивали гематоксилином - эозином и проводили морфологическое и морфометрическое исследование. Также осуществляли окраску трихромным методом по Массону с анилиновым синим, проводили ШИК-реакцию для оценки состояния базальных мембран сосудистого клубочка и эпителия канальцев. Микроскопическое исследование производили на микроскопе Leica DM 2500, анализ изображений выполняли в программе ВидеоТест «Морфология» 5.0. Оценивали относительное количество ( %) поврежденных клубочков, среднюю площадь (мкм2) сосудистого клубочка и мочевого пространства клубочка (мкм2). Проводили подсчет мезангиальных клеток, локализованных в пространстве между капиллярными петлями сосудистого клубочка в расчете на единицу площади (кл/ мм2). Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) маркера клеточной пролиферации Ki-67 (clone ММ1, Leica, Англия) и маркера макрофагов CD68 (clone ED1, Millipore, США) в почках у животных проводили по стандартному протоколу с использованием Autostainer DAKO на срезах толщиной 3-4 мкм. Фиксация образцов для ИГХ проводилась с использованием 10 % нейтрального формалина (Ki-67) и фиксатора Буэна (CD68) [13]. Для реакции с CD68 проводили демаскировку антигенов трипсином, для реакции с Ki-67 - высокотемпературную обработку срезов в цитратном буфере, pH 6,0. Для устранения неспецифического связывания антител использовали блокирующий раствор BlockAid (Thermo Fisher, США). Первичные mouse-anti-rat антитела и вторичные поликлональные антитела biotin-goat-anti-mouse (BD, США) использовали в разведении 1:50. Визуализацию проводили с помощью непрямой иммунопероксидазной методики, использовали позитивный и негативный контроль антигенов для исключения неспецифического окрашивания. Определяли количество клеток, экспрессирующих CD68 и Ki-67 в клубочках и канальцах на единице площади среза почки при увеличении 400 в 20 полях зрения каждого образца с последующим пересчетом на 1 мм2. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft Inc., USA). Оценку статистической значимости различий полученных данных в сравниваемых выборках осуществляли с использованием непараметрического критерия (U) Манна-Уитни. При проверке статистических гипотез учитывали уровень значимости 5 % (р<0,05). Данные представлены в виде среднего значения и его стандартной ошибки. Результаты исследования. Между показателями крови у животных 1-й контрольной и интактной группы (глюкоза, HbA1c, инсулин, мочевина, креатинин) не было обнаружено значимых различий (таблица). Во 2-й группе крыс (СД 30 сут) содержание глюкозы, гликированного гемоглобина, мочевины и креатинина возрастало, а содержание инсулина достоверно снижалось по сравнению с показателями 1-й интактной группы (см. таблицу). У животных 3-й группы (СД 60 сут), не получавших лечение, и 6-й группы эти показатели оставались на уровне значений у крыс 2-й группы (см. таблицу). У крыс 4-й группы (СД+АФГ) значительно снизилось содержание глюкозы, нормализовались уровни гликированного гемоглобина, мочевины и креатинина по сравнению с соответствующими показателями 2-, 3-й и 6-й групп. Содержание инсулина в плазме крови у крыс 4-й группы превысило значение этого показателя у интактных крыс, но различие не было достоверным. Гистологическое исследование почек у интактных животных и почек у животных 5-й группы показало отсутствие структурных изменений в органе. При морфологическом исследовании почек у крыс 2-й группы на 30-е сутки СД определялись полнокровие капилляров сосудистого клубочка и очаговое утолщение базальных мембран эндотелия (рис. 1, в). Это приводило к возникновению межпетлевых спаек и формированию поврежденных клубочков (см. рис. 1, б). Клубочки отличались по размерам, некоторые из них были увеличены за счет отека стромы клубочка, другие уменьшены за счет деструкции эндотелия (см. рис. 1, а). На 60-е сутки развития диабета (3-я группа) структурные изменения в паренхиме органа были более выраженными по сравнению с изменениями у диабетических крыс на 30-е сутки (рис. 2, а). Обнаруживались дистрофические изменения эпителия извитых канальцев, гиалиноз артериол, очаговый склероз интерстиция почки и гломерулосклероз (см. рис. 2, б). В участках расширения мезангиума клубочков определялись ШИК-позитивные массы, мочевое пространство капсулы клубочка увеличивалось (см. рис. 2, в). При введении дистиллированной воды экспериментальным животным с СД 30 сут (6-я группа) структурные изменения в органе соответствовали изменениям в группе СД 60 сут (рис. 3). При морфологическом исследовании почек крыс 4-й группы (СД и введение АФГ) определялись мономорфные клубочки, в которых капиллярные петли были с равномерным кровенаполнением (рис. 4, а). Склеротических изменений интерстиция почки не обнаруживалось (см. рис. 4, б). Базальные мембраны капилляров не изменялись, а дистрофические изменения эпителия канальцев были минимальные (см. рис. 4, в). При морфометрическом исследовании на 30-е сутки СД у крыс 2-й группы отмечали уменьшение площади сосудистых клубочков, что приводило к увеличению мочевого пространства в капсуле Шумлянского-Боумена (рис. 5, а, б). Также во 2-й группе установлено существенное снижение пролиферативной активности мезангиальных клеток и клеток нефроэпителия по анализу экспрессии позитивных по Ki-67 клеток (см. рис. 2 в, г). На 60-е сутки СД у крыс 3-й группы морфометрические показатели в целом соответствовали показателям у крыс с длительностью СД 30 сут. Исключение составляло уменьшение количества позитивных по Ki-67 клеток, что свидетельствовало о снижении пролиферативной активности (рис. 6, б). Введение АФГ крысам 4-й группы (СД+АФГ) существенно повышало пролиферативную активность мезангиальных клеток сосудистого клубочка и эпителия канальцев (рис. 5, г). Иммуногистохимический анализ CD68-позитивных клеток показал их снижение в клубочках и перитубулярном интерстиции диабетических крыс на 30-е и 60-е сутки эксперимента (2-я и 3-я группы) и отсутствие нормализации этих показателей после введения АФГ в 4-й группе (см. рис. 5, д, е; рис. 7). Обсуждение полученных данных. Диабетическая ангиопатия является распространенным осложнением сахарного диабета, поэтому в почках наиболее уязвим сосудистый клубочек [4, 11]. В результате проведенного исследования установлено, что на 30-е сутки СД у крыс нарушается структура клубочков, канальцев и интерстиция почки. Наряду с гломерулярным повреждением, нами обнаружены структурные нарушения канальцевого эпителия и формирование интерстициального фиброза. К 60-м суткам СД показано существенное снижение экспрессии позитивных по Ki-67 клеток, что указывает на прогрессирование диабетической нефропатии. Данный факт подтверждается также увеличением содержания мочевины и креатинина в крови в динамике развития сахарного диабета. В настоящее время установлено, что макрофаги могут влиять на интенсивность регенераторных процессов почки при ее повреждении, вырабатывая факторы, оказывающие влияние на пролиферацию канальцевых эпителиоцитов [5, 12]. Так, удаление макрофагов в эксперименте усиливает воспаление и замедляет течение регенераторных процессов [12]. Нарушение регуляторной функции макрофагов усугубляется при СД 1-го типа вследствие окислительного стресса и обменных нарушений [6, 14], поэтому изменение активности макрофагов может быть многообещающей новой терапией для ингибирования прогрессирования диабетической нефропатии. В нашем исследовании в качестве вещества, влияющего на функциональную активность макрофагов, использован АФГ. АФГ ингибирует продукцию макрофагами провоспалительных цитокинов, таких как IFN-α, TNF-α, IL-1, IL-6, нитросоединений, и способствует увеличению выработки комплекса факторов роста, снижает окислительный стресс в мононуклеарных фагоцитах, стимулированных LPS in vitro [9, 10]. В ранее проведенных исследованиях была показана эффективность стимуляции регенераторных процессов в поджелудочной железе и миокарде при стимуляции активности макрофагов АФГ [7, 8]. В нашем эксперименте введение крысам АФГ, начиная с 30 сут СД, способствовало значительному снижению доли поврежденных клубочков - объективного прогностического критерия диабетической нефропатии [4, 11]. Структурный анализ почек у животных этой группы показал частичное восстановление базальных мембран капилляров, уменьшение площади мочевого пространства капсулы клубочка за счет увеличение числа мезангиальных клеток. ИГХ-анализ экспрессии Ki-67 выявил повышение пролиферативной активности мезангиальных клеток в сосудистых клубочках и клеток канальцевого эпителия. Мы полагаем, что установленное нами частичное восстановление структур сосудистого клубочка и эпителия канальцев связано с активацией функциональной активности макрофагов АФГ. Известно, что экспрессия CD68+ характерна для всех типов макрофагов независимо от их дифференцировки на функциональные фенотипы [2]. Нами выявлено снижение количества CD68+-клеток в почках у диабетических крыс. Стимуляция активности макрофагов без увеличения их количества приводила к повышению исследуемых морфометрических показателей процессов регенерации. Таким образом, у крыс с аллоксан-индуцированным СД введение стимулятора функциональной активности макрофагов АФГ способствовало активации регенераторных процессов гломерулярного и канальцевого аппарата почки и снижало выраженность морфологических диабетических изменений. Исследования выполнены при поддержке гранта РНФ, № проекта 16-15-00039. Вклад авторов Концепция и дизайн исследования: И. Г. Д., М. Т. А. Сбор и обработка материала: И. Ф. Г., Н. Б. Б., С. Ю. М. Статистическая обработка данных: Н. Б. Б. Анализ и интерпретация данных: В. А. Ч. Написание и редактирование текста: И. Г. Д., И. Ф. Г., А. В. Б., С. Ю. М., Н. Б. Б. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

I. G. Danilova

First President of Russia B. N. Yeltsin Ural Federal University; RAS Ural Branch, Institute of Immunology and Physiology

Email: ig-danilova@yandex.ru
Department of Medical Biochemistry and Biophysics; Laboratory of Morphology and Biochemistry 19 Mira Str., Yekaterinburg 620002; 106 Pervomaiskaya Str., Yekaterinburg 620049

V. A. Chereshnev

RAS Ural Branch, Institute of Immunology and Physiology

Email: secretar@iip.uran.ru
Laboratory of Immunophysiology and Immunopharmocology 106 Pervomaiskaya Str., Yekaterinburg 620049

N. B. Blinkova

RAS Ural Branch, Institute of Immunology and Physiology

Email: n.b.krohina@mail.ru
Laboratory of Morphology and Biochemistry 106 Pervomaiskaya Str., Yekaterinburg 620049

S. Yu. Medvedeva

First President of Russia B. N. Yeltsin Ural Federal University; RAS Ural Branch, Institute of Immunology and Physiology

Email: medvedeva-ran@yandex.ru
Department of Medical Biochemistry and Biophysics; Laboratory of Morphology and Biochemistry 19 Mira Str., Yekaterinburg 620002; 106 Pervomaiskaya Str., Yekaterinburg 620049

I. F. Gette

First President of Russia B. N. Yeltsin Ural Federal University; RAS Ural Branch, Institute of Immunology and Physiology

Email: i.goette@yandex.ru
Department of Immunochemistry; Laboratory of Morphology and Biochemistry 19 Mira Str., Yekaterinburg 620002; 106 Pervomaiskaya Str., Yekaterinburg 620049

A. V. Belousova

First President of Russia B. N. Yeltsin Ural Federal University; RAS Ural Branch, Institute of Immunology and Physiology

Email: a1b2v3@mail.ru
Department of Immunochemistry; Laboratory of Morphology and Biochemistry 19 Mira Str., Yekaterinburg 620002; 106 Pervomaiskaya Str., Yekaterinburg 620049

M. T. Abidov

First President of Russia B. N. Yeltsin Ural Federal University

Email: alina44@mail.ru
Department of Medical Biochemistry and Biophysics 19 Mira Str., Yekaterinburg 620002

References

Supplementary files