РАСПРЕДЕЛЕНИЯ NADPH-ДИАФОРАЗЫ И НЕЙРОНАЛЬНОЙ NO-СИНТАЗЫ В ЯДРАХ ПРОДОЛГОВАТОГО МОЗГА КРЫСЫ

Полный текст

В настоящее время накоплен большой объем информации о нейронной организации нитроксидергических систем мозга. Повышенный интерес исследователей к оксиду азота (NO) во многом объясняется его участием в обеспечении многообразных функций нейрона [2, 5, 6, 8, 12, 17, 21]. В связи с этим приобретают особую важность знания о распределении NO-ергических нейронов в мозгу. Однако пока не сложилось единого мнения ни о топографии, ни о численности нейронов, в которых экспрессируются ферменты синтеза NO, и, прежде всего, нейрональная форма синтазы NO (nNOS), которая в физиологических условиях участвует в синтезе этого газа в нервных клетках [8, 9, 12]. О локализации nNOS в структурных образованиях мозга часто судят по наличию в них активности NADPH-диафоразы, поскольку в некоторых нейронах последняя колокализована с nNOS [11, 14–16]. Хотя результаты гистохимического выявления NADPH-диафоразы и иммуногистохимического — nNOS довольно часто не совпадают [13, 19, 21], для изучения NO-ергических систем мозга до сих пор широко используется гистохимическая реакция на NADPH-диафоразу. Цель настоящего исследования — сравнительное исследование топографии и численности NADPH-диафоразо-и nNOS-позитивных нейронов в некоторых ядрах продолговатого мозга крыс. Материал и методы. Исследование проведено на крысах линии Вистар (n=8) массой 240–280 г, содержавшихся в условиях лабораторного вивария на стандартном рационе. Экспериментальные манипуляции производили в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1077 г. МЗ СССР). Животных выводили из эксперимента передозировкой 3% раствора тиопенталнатрия. Из полости черепа извлекали головной мозг, отделяли продолговатый мозг, фиксировали его в течение 1 чв 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) при 4 ºС, после чего на криостате делали срезы толщиной 30 мкм. NADPH-диафоразу в нейронах выявляли гистохимическим (ГХ) методом B. T. Hope и S. R. Vinсent [16]. Специфичность реакции проверяли инкубацией нескольких срезов в растворах, не содержащих NADPH или содержащих NADP вместо NADPH. Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования использовали поликлональные антитела кролика против nNOS (ICN, Biomedicals, СШA, 1:5000). Для выявления продукта реакции срезы инкубировали, используя стрептовидинпероксидазный комплекс (Biomedicals, Германия), стандартную авидин-биотиновую систему визуализации ABCкомплекса (Vectastain Elite АВС Kit, Vector Labs, Burlingame, США). Оценку специфичности реакции проводили при окрашивании срезов без первичных или вторичных антител. Изучали ядро одиночного пути (ЯОП), ретикулярные гигантоклеточное (РГЯ), парагигантоклеточное (РПГЯ), мелкоклеточное (РМЯ) и латеральное (РЛЯ) ядра, дорсальное ядро блуждающего нерва (ДЯБН), двойное ядро (ДЯ), ядро подъязычного нерва (ЯПН), спинномозговое ядро тройничного нерва (СПМЯ). Для этого в серии из последовательных срезов мозга один — окрашивали раствором метиленового синего, 2-й — использовали для ГХ, третий — для ИГХисследования. В проекции среза каждого ядра определяли площадь профильного поля нейронов (мкм2), общее количество клеток, выявленных при окраске метиленовым синим, долю, приходящуюся отдельно на NADPH-диафоразо-и nNOS-позитивные нейроны, а также количество этих клеток из расчета на 0,01 мм3 (относительную плотность), как это было описано нами ранее [6]. Все нейроны в соответствии с площадью их тела были разделены на 3 размерные группы: мелкие (50–250 мкм2), средние (251–680 мкм2) и крупные (свыше 681 мкм2). Количественную обработку материала проводили с использованием компьютерных программ автоматизированной системы анализа изображений Allegro-MC [1]. Данные количественного анализа представляли в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего, полученных при обработке не менее 12 срезов каждого ядра. Для оценки значимости цифровых данных применяли t-критерий Стьюдента. Различия считали значимыми при Р<0,05. Результаты исследования. Во всех изученных ядрах мозга выявляются NO-позитивные нейроны, которые различаются по форме, размеру, плотности расположения, интенсивности реакции (рис. 1). Большинство тел нейронов имеют округлую, веретеновидную или треугольную форму. Реже наблюдаются клетки полигональной, ав единичных случаях звездчатой формы. В отдельных ядрах (РГЯ, РПГЯ) или между ними встречается ограниченное количество (около 1%) гигантских пирамидных нейронов с площадью сечения тела свыше 2–2,5 тыс. мкм2, которые обладают активностью NADPH-диафоразы, но не выявляются при реакции на nNOS. Иммунонегативными являются многие отростки нейронов и капилляры, а также более крупные сосуды, которые при ГХ-исследовании нередко в большом количестве наблюдаются в проекции ядер (см. рис. 1, а, в). При сопоставлении данных, полученных при ГХ-и ИГХ-исследовании одноименных ядер, в ряде случаев определяются существенные различия доли мелких, средних и крупных нейронов (рис. 2). Как видно, экспрессия nNOS наблюдается преимущественно в мелких нейронах. Локализация NADPH-диафоразы в меньшей степени связана с их размерами: наряду с небольшими нейронами, активность фермента часто определяется в средних и крупных. Доля крупных NADPH-диафоразо-позитивных нейронов выше в двигательных ядрах, в которых метиленовым синим также определяется наибольшее количество таких клеток (ДЯ, ЯПН, РГЯ, РПГЯ). В ДЯ и ЯПН на долю мелких клеток, содержащих этот фермент, приходится чуть больше 20%, но свыше 70% иммунопозитивных нейронов. В ядрах, известных своими сенсорными или ассоциативными функциями (ЯОП, РМЯ, РЛЯ, СПМЯ), крупные нейроны встречаются относительно редко при ГХ-и в единичных случаях — при ИГХ-исследовании (см. рис. 2). Количество NO-ергических нейронов напрямую не связано с численностью клеток, окрашивающихся метиленовым синим (рис. 3, а). При этом ГХ-методом всегда определяется больше NO-позитивных нейронов, чем при использовании ИГХ-реакции. Например, из 696 нейронов, которые выявляются при окраске метиленовым синим в проекции ЯОП, 170 (24,4%) обладают активностью NADPH-диафоразы и лишь 86 (12,6%) — являются иммунопозитивными. Тогда как в СПМЯ на долю NADPH-диафоразо-позитивных нейронов приходится 18,9%, ИМХ — лишь 9,7% (из 812 клеток, окрашивающихся метиленовым синим, ГХ-методом определяются 154 нейрона, ИМХ — 79). В РМЯ из 704 клеток, окрашивающихся метиленовым синим, ГХ-методом выявляются 287 (40,8%), ИМХ — 201 (28,6%). Сходные результаты получены при изучении количественного распределения NADPH-диафоразо-и иммунопозитивных нейронов в других исследованных ядрах (см. рис. 3, а). Наиболее значительные отличия количества нейронов, связанные с методом их выявления, установлены в ДЯ и ЯПН. В первом — на долю NADPH-диафоразо-позитивных клеток приходится 75,8%, маркированных при реакции на nNOS — около 8%, во втором — ГХ-методом определяется 87,9%, ИГХ — 5,8%. В тех случаях, когда NO-ергических нейронов много и они располагаются довольно плотно, значения концентрации клеток в ядре выше (см. рис. 3, б). Поэтому в одноименных ядрах величина показателя при ИМХ-исследовании всегда ниже, чем при использовании ГХ-метода. Однако поскольку величина этого показателя зависит не только от количества нейронов, но и от их размеров, даже не самое большое количество клеток при их малых размерах приводит к существенному приросту их относительной плотности. В связи с этим, различия величины показателя, вычисленные при использовании ГХ-и ИГХ-методов, в СПМЯ и ДЯБН выражены меньше, чем в других центрах (РГЯ, РПГЯ, ДЯ), в которых определяются хотя и крупные, но многочисленные нейроны, обладающие активностью NADPH-диафоразы, однако имеется весьма ограниченное число иммунопозитивных клеток. Обсуждение полученных данных. В начале 60-х годов E. Thomas и A. G. E. Pearse [18] при изучении мозга использовали новый тогда гистохимический метод для выявления активности NADPH-диафоразы, способной восстанавливать окисленную форму NADP. В различных отделах мозга авторами было выявлено небольшое количество (около 2%) редко расположенных нейронов с интенсивной ферментной реакцией, за что они получили название «одиночные активные клетки». Однако интерес к этому ферменту вновь возродился после появления публикаций (прежде всего, B. T.Hope и S. R. Vincent — авторов усовершенствованной версии использованного ранее метода) — о том, что высокой активности NADPH-диафоразы в отдельных нейронах сопутствует экспрессия конститутивных форм NOS, участвующих в синтезе одного из важнейших представителей нового класса передатчиков нервного импульса — NO [11, 15, 16]. Нашлось и объяснение этому феномену. Оказалось, что в некоторых случаях конститутивные NOS, кроме способности катализировать образование NO, обладают NADPH-диафоразной активностью, используя восстановленную форму NADPH как кофактор в качестве донора электронов при синтезе NO. Позднее как-то забылось, что речь шла об «отдельных клетках» ио «высокой активности NADPH-диафоразы», явление распространили на всю популяцию NO-ергических нейронов. NADPH-диафоразу стали отождествлять с конститутивными NOS, в частности, с nNOS, несмотря на то, что они отличаются не только функционально и биохимически [8, 12, 17], но и распределением на клеточном и субклеточном уровнях [9, 10, 13, 20, 21]. Неслучайно многие клетки, обладающие активностью NADPH-диафоразы, при двойном маркировании остаются иммунонегативными после использования антисыворотки к nNOS, что нашло подтверждение на материале, полученном от различных видов животных при изучении нескольких отделов головного, а также спинного мозга и некоторых других органов [10, 13, 17, 19, 21]. Однако эти, несомненно, интересные наблюдения оставляли сомнения, поскольку в большинстве случаев не были подкреплены количественными данными. Восполняя этот пробел, мы провели сравнительное изучение топографии и количественного распределения нейронов, выявленных каждым из указанных методов, в ядрах продолговатого мозга крыс. Полученные данные показывают, что в стволе мозга NO-ергические нейроны распределены крайне неравномерно, но во всех ядрах, наряду с NADPH-диафоразо-позитивными, находятся нейроны с положительной реакцией на nNOS. Вместе с тем, установлены существенные отличия локализации и численности каждого из этих двух типов нейронов в исследованных нами ядрах. Так, в двигательных ядрах доля нейронов, обладающих активностью NADPH-диафоразы, всегда выше, чем в чувствительных и ассоциативном ядрах. В некоторых ядрах (ДЯ, ЯПН), включающих многочисленные NADPH-диафоразопозитивные нейроны, клетки, экспрессирующие nNOS, выявляются особенно редко. При ИГХисследовании наблюдается обратная зависимость: в чувствительных и ассоциативном ядрах (ЯОП, РЛЯ, СПМЯ, РМЯ) содержание таких нейронов выше, чем в двигательных ядрах. Во всех случаях в одноименных ядрах ГХ-методом определяется в 1,5–3 раза больше клеток, чем ИГХ. Причину этих различий еще предстоит выяснить, но стоит заметить, что специфичность ИГХ-метода для определения локализации nNOS доказана многочисленными работами и сомнений не вызывает, в связи с чем для идентификации NO-ергических нейронов он имеет несомненное преимущество перед ГХ-методом, при котором количество выявленных клеток зависит от большого числа факторов [3, 14–16]. Сравнительное изучение клеточного состава ядер, проведенное нами на параллельных срезах, обработанных метиленовым синим, а также для ГХ-и ИГХ-исследования, позволило установить еще одно различие в распределении двух типов нейронов. Оказалось, что nNOS находится преимущественно в мелких клетках, тогда как NADPH-диафораза, кроме того, выявляется в довольно многочисленной группе средних и крупных нейронов. В том и другом случае соотношение мелких, средних и крупных клеток отличается от соответствующих значений, вычисленных на препаратах, окрашенных метиленовым синим. Хотя по этому поводу высказывается и другое мнение: соотношение мелких и крупных NADPHдиафоразо-позитивных нейронов в ядрах мозга вполне сопоставимо со значениями численности таких клеток, выявленных метиленовым синим [4]. Отдельный вопрос — об отростках NO-позитивных нейронов. При ГХ-исследовании постоянно выявляются клетки с многочисленными длинными или короткими отростками. Наличие хорошо развитой системы чувствительных и эфферентных проводников с разной степенью активности NADPH-диафоразы неоднократно отмечалось в головном и спинном мозгу, в составе сосудистых и интрамуральных нервных сплетений, методами световой и электронной микроскопии [2, 3, 6, 7, 12]. В отличие от него, ИГХ-метод позволяет выявить ограниченное число отростков, которые, по оценкам специалистов [9, 10, 17], являются исключительно дендритами нейронов. Таким образом, несмотря на некоторые общие признаки клеточной локализации NADPHдиафоразы и nNOS в ядрах продолговатого мозга, существуют явные различия топографии и количественного распределения нейронов, экспрессирующих эти два фермента, что заставляет с необходимой осмотрительностью относиться к материалам, полученным при изучении NO-ергических нейронов ГХ-методом на NADPH-диафоразу.

Об авторах

Виктор Михайлович Черток

Тихоокеанский государственный медицинский университет

Email: chertoky@mail.ru
кафедра анатомии человека 690990, Владивосток, пр. Острякова, 2

Александр Евгеньевич Коцюба

Тихоокеанский государственный медицинский университет

Email: akotc@mail.ru
кафедра анатомии человека 690990, Владивосток, пр. Острякова, 2

Список литературы

Дополнительные файлы