REGULATORY ELEMENTS IN THE SKIN EPITHELIUM OF SACCOGLOSSUS MERESCHKOWSKII (ENTEROPNEUSTA, HEMICHORDATA): ELECTRON MICROSCOPIC AND IMMUNOCYTOCHEMICAL STUDY

Full Text

Кишечнодышащие (Enteropneusta) относятся к полухордовым животным (Hemichordata). В филогенетической системе они находятся у основания ветви хордовых, ствола вторичноротых, и представляют собой уникальный объект для сравнительно-морфологических исследований. Молекулярно-биологические данные свидетельствуют, что кишечнодышащие среди современных животных наиболее близки к древним вторичноротым [8, 10]. В связи с этим изучение эпителиальных тканевых систем, их клеточного состава и клеточных взаимодействий у кишечнодышащих важно для понимания эволюционного становления эпителиальных тканей и формирования тканевых регуляторных механизмов. В основании кожного эпителия кишечнодышащих расположен нервный слой, представленный нервными клетками и нервными волокнами. Строение кожного эпителия у разных видов кишечнодышащих описано на светооптическом и электронно-микроскопическом уровнях [1, 2, 6, 7]. Кожный эпителий Saccoglossus mereschkowskii — однослойный ложномногорядный реснитчатый, толщина которого достигает 200–300 мкм и более [1]. В кожном эпителии кишечнодышащих выделяют реснитчатые клетки и несколько видов железистых клеток. Реснитчатые клетки содержат в апикальной части миофиламенты и представляют собой эпителиально-мышечные клетки [6]. На светооптическом уровне выявлены чувствительные клетки с помощью окраски метиленовым синим [9] и импрегнации нитратом серебра [14]. Типичные эндокринные клетки в эпителиях у кишечнодышащих не обнаружены. Однако с помощью иммуноцитохимических методов у Saccoglossus и Ptychodera bahamensis выявлено присутствие гонадотропин-рилизинг гормона, который обнаруживается в гранулах зернистых клеток кожного эпителия [11]. Поскольку гранулы этих клеток выделяются наружу, авторами предполагается экзокринная функция гормона. Цель настоящего исследования — выявление регуляторных элементов кожного эпителия у представителя кишечнодышащих Saccoglossus mereschkowskii. Материал и методы. В качестве объекта исследования выбран широко распространенный вид — Saccoglossus mereschkowskii (Enteropneusta, Hemichordata). Работу по сбору и фиксации животных проводили на базе Мурманского морского биологического института. Материал для исследования собирали в летний период (июль) на литорали побережья Баренцева моря в районе Дальних Зеленцов. Для электронно-микроскопического изучения животных рассекали в поперечном направлении на небольшие фрагменты и фиксировали на холоду (при 4 ºС) 2,5% глутаральдегидом на фосфатном или какодилатном буфере при рН 7,4 в течение 40–60 мин, после чего дофиксировали 1–2% раствором четырехокиси осмия. Тоничность фиксирующих жидкостей доводили до уровня тоничности морской воды (для Баренцева моря — 1000 мосмолей) добавлением сахарозы или хлористого натрия. Фиксированный материал после обезвоживания по стандартной методике заключали в аралдит. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим. Ультратонкие срезы получали на ультратоме (LKB, Швеция) и контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и исследовали в электронных микроскопах JEM-5G и JEM-7 (Jeol, Япония). Иммуноцитохимическим методом определяли локализацию нейропептида FMRFамида с целью выявления рецепторных (нейросенсорных) и регуляторных элементов. FMRFамидподобные пептиды рассматриваются как нейротрансмиттеры/нейромодуляторы, а их наличие в эндокринных клетках кишечника насекомых дает основание предполагать, что они являются гормонами [12]. Для иммуноцитохимического исследования использовали животных, фиксированных в жидкости Буэна в течение 24 ч. Иммуноцитохимическую реакцию проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 5–6 мкм. Срезы депарафинировали, промывали 20 мин в воде и помещали на 30 мин в 1% перекись водорода для инактивации эндогенной пероксидазы. После промывки в воде препараты выдерживали 30 мин в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (PBS) при pH 7,4, содержащем 0,3% Тритон Х-100 (PBS-TX). Для устранения неспецифического окрашивания препараты выдерживали в PBS-TX, содержащем 2,5% бычий альбумин (PBS-TX — BSA), в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали с поликлональными кроличьими антителами к FMRFамиду (ImmunoStar, США) в разведении 1:1000–1:2000 на PBS-TX — BSA в течение 3 ч при комнатной температуре. После промывки в PBS-TX срезы обрабатывали вторыми биотинилированными антителами против иммуноглобулинов кролика в течение 20 мин и стрептавидин-пероксидазой (DAKO, Дания) в течение 10 мин. Для визуализации продукта реакции использовали 3,3'-диаминобензидин. Контролем служили срезы, обработанные только вторыми антителами. Препараты исследовали под световым микроскопом Leica DME (Leica, Германия), изображения структур были получены с помощью цифровой видеокамеры Leica ES3 (Leica, Германия). На гистологических препаратах с помощью окулярного микрометра, а на электронных микрофотографиях — с помощью измерительной системы определяли количественные параметры тканевых и клеточных структур. Результаты исследования. Электронномикроскопическое исследование показало, что в образовании интраэпителиального нервного слоя кожного эпителия у S. mereschkowskii принимают участие базальные отростки некоторых эпителиальных клеток. Можно наблюдать, как на границе с нервным слоем базальные отростки эпителиальных клеток поворачивают вдоль нервного слоя и входят в него (рис. 1, а). Отсутствие гранул в цитоплазме отростков позволяет предположить, что эпителиальные клетки с базальными отростками в нервном слое относятся к реснитчатым клеткам. Зернистые клетки, представленные крупно-и мелкозернистыми клетками, прослеживаются от поверхности эпителия до базальной мембраны. Их цитоплазму заполняют округлые ограниченные мембраной секреторные включения, диаметр которых в крупнозернистых клетках колеблется от 0,3 до 1,2 мкм, в мелкозернистых — содержатся включения диаметром 0,09–0,2 мкм. Электронная плотность гранул крупно-и мелкозернистых клеток варьирует. Содержимое более светлых гранул имеет вид мелких зерен и нитей, материал электронно-плотных гранул при малых увеличениях электронного микроскопа выглядит аморфным, но при большем разрешении выявляется его тонкофибриллярная структура. В крупнозернистых клетках разные виды секреторных гранул встречаются примерно в одинаковом количестве, в мелкозернистых клетках преобладают электронно-плотные гранулы. Секреторные гранулы присутствуют в апикальных, центральных и базальных частях зернистых клеток. Базальные части мелкозернистых клеток обнаружены в составе слоя нервных волокон (см. рис. 1, б). Установлено выделение секрета из гранулы крупнозернистой клетки на границе с базальной мембраной (рис. 2, а). Полученные данные позволяют предположить, что зернистые клетки выделяют секрет как по экзокринному, так и по эндокринному типу и представляют собой регуляторные эндокриноподобные клетки. Нервный слой образован идущими параллельно поверхности волокнами диаметром от 0,2 до 1,0 мкм, направление которых в основном совпадает с длинной осью тела животного. Многие волокна имеют гранулы диаметром от 0,06 до 0,15 мкм со светлым или темным содержимым, рассеянные диффузно или образующие небольшие скопления. Диаметр и содержимое гранул варьируют. Можно различить следующие типы гранул: первый — сферические гранулы диаметром 150–200 нм умеренной электронной плотности (см. рис. 2, г); второй — умеренно электронно-плотные гранулы диаметром 50–100 нм (см. рис. 2, г); третий — гранулы сферической или овальной формы диаметром 60–150 нм с узким светлым гало и электронно-плотной сердцевиной (см. рис. 2, д); четвертый — сферические гранулы диаметром 40–70 нм со светлым гомогенным содержимым (см. рис. 2, е); пятый — сферические гранулы диаметром 80–100 нм со светлым гетерогенным содержимым (см. рис. 2,е). В одном волокне могут находиться одновременно и электронно-плотные, характерных для позвоночных и беспозвоночных животных. Гранулы первого-третьего типов сходны с крупными гранулами эндокринных, эндокриноподобных и светлые гранулы. В глубине эпителия на границе с нервным слоем выявлены нейроноподобные клетки с светлыми ядрами округлой формы, образующие и пептидергических нейросекреторных клеток, с соседними клетками синапсоподобные контакты по типу щелевого соединения. Обнаружены контакты терминалей нервных волокон, содержащих пузырьки, подобные синаптическим, и железистых (зернистых) клеток (см. рис. 2, ж), что указывает на нейрональную регуляцию функции зернистых клеток. Отдельные нервные окончания, содержащие синаптические пузырьки, контактируют с базальной мембраной (см. рис. 2, ж). Данный факт свидетельствует о том, что регуляция функции мышц может осуществляться путем диффузии медиатора через базальную мембрану в гемальные пространства. Это предположение объясняет отсутствие непосредственных контактов между нервными и мышечными элементами. Методом иммунопероксидазной цитохимии на светооптическом уровне в цитоплазме узких клеток открытого типа (достигающих поверхности) и в отростках клеток, уходящих в нервный слой, показана локализация FMRFамидиммунореактивного материала (см. рис. 2, б, в). По строению и расположению FMRFамидиммунореактивные элементы соответствуют зернистым клеткам, что подтверждает высказанное предположение о роли зернистых клеток как регуляторных эндокриноподобных клеток. Также FMRFамид-иммунореактивность проявляют нервные клетки, расположенные на уровне нервного слоя в основании эпителия. Обсуждение полученных данных. В настоящей работе показано, что интраэпителиальный нервный слой кожного покрова S. mereschkowskii образован как нервными волокнами, так и входящими в него базальными отростками некоторых эпителиальных клеток. По строению эти клетки соответствуют реснитчатым клеткам. Реснитчатые клетки, направляющие базальные отростки в нервный слой, по-видимому, являются рецепторными элементами. Это заключение согласуется с тем, что специальные органы чувств у кишечнодышащих отсутствуют. В кожном и кишечном эпителиях представителей многих групп беспозвоночных нейроноподобные, эндокриноподобные и рецепторные клетки могут иметь на поверхности реснички или микроворсинки [4, 5]. Показано, что мембрана всех ресничек содержит специфические рецепторы и ионные каналы, которые запускают сигнальные механизмы, контролирующие подвижность ресничек и/или реагирующие на механические или химические стимулы [13]. В частности, плазматическая мембрана жгутиков обонятельных клеток содержит хемосенсорные рецепторные молекулы [3]. Анализ данных литературы позволяет сделать заключение, что чувствительные реснитчатые клетки могут осуществлять хеморецепцию и, возможно, обеспечивают тактильную чувствительность [3, 13]. Зернистые клетки кожного эпителия S. mereschkowskii обладают как экзокринной, так и эндокринной секрецией, что дает основание рассматривать их как регуляторные эндокриноподобные клетки. Выявленная локализация FMRFамидиммунореактивного материала в зернистых эпителиальных клетках открытого типа и клеточных отростках, идущих в нервный слой, подтверждает данные электронной микроскопии о роли их как эндокриноподобных клеток. Мелкозернистые клетки, которым некоторые авторы придают значение рецепторных [15], представляют собой, по-видимому, особые рецепторноэндокриноподобные клетки. Обнаруженные контакты нервных волокон и зернистых клеток свидетельствуют о нейрональной регуляции функции зернистых клеток. Полученные данные позволяют сделать вывод о существовании в кожном эпителии кишечнодышащих своеобразной нейроэндокринной регуляторной системы, представленной рецепторными и рецепторно-эндокриноподобными клетками открытого типа и нервными элементами нервного слоя. Можно предполагать, что биологически активные вещества, выделяемые через базальные части эндокриноподобных зернистых клеток и синапсоподобные окончания нервных клеток, не только регулируют деятельность самих эпителиальных клеток, включая мерцательную, сократительную и секреторную активность, но и выделяются через базальную мембрану в гемальные пространства, осуществляя гуморальную регуляцию.

About the authors

M. V. Stolyarova

St. Petersburg State Pediatric Medical University

Email: mvstolyarova@yandex.ru

E. I. Valkovich

St. Petersburg State Pediatric Medical University

References

Supplementary files