CALBINDIN-IMMUNOREACTIVE INTERNEURONS OF THE SPINAL CORD GRAY MATTER INTERMEDIATE ZONE AND VENTRAL HORNS IN ALBINO RAT

Full Text

Интернейроны спинного мозга (СМ) представлены множеством различных субпопуляций, которые образуют соединения с другими нейронами различной локализации и функционального назначения. Характерной особенностью интернейронов вентрального рога и промежуточной зоны серого вещества СМ является участие в модуляции возбудимости мотонейронов. Сложность изучения интернейронов СМ - в их нейрохимическом разнообразии, которое с позиций фукциональной принадлежности до сих пор не полностью объяснено. В настоящее время широко исследуются кальций-связывающие белки, по которым определяют различные функциональные классы интернейронов СМ. Считается, что для некоторых клеточных субпопуляций интернейронов СМ специфичным маркером является кальбиндин (КБ). Клетки Реншоу вентрального рога и Iа-ингибиторные интернейроны промежуточной зоны, обеспечивая взаимное торможение мотонейронов, развиваются из одного класса эмбриональных V1-нейронов и содержат КБ уже на этапе нейрогенеза [6, 9], иммунореактивность (ИР) к которому сохраняется и в СМ у взрослых животных [2]. Целью данного исследования явилось изучение топографии и структуры интернейронов, ИР к КБ с молекулярной массой 28 килодальтон (calbindin 28 kDa) в вентральном роге и промежуточной зоне серого вещества грудного и поясничного отделов СМ. Материал и методы. Исследование проведено на самках крыс линии Вистар (n=4), массой 200±10 г. Эвтаназию животных осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» под уретановым наркозом (3 г/кг внутрибрюшинно) путем транскардиальной перфузии фосфатно-солевого буфера (PBS), 0,01 М, pH 7,4 (БиолоТ, Россия), содержащего гепарин (5 ЕД/л), затем - 4% раствор параформальдегида (Sigma, США) на PBS. Извлеченный СМ с корешками фиксировали в 4% растворе параформальдегида на PBS в течение 2 ч при 4 ºС, после чего промывали 3-кратно в PBS в течение 30 мин и оставляли в 30% растворе сахарозы (Panreac, Испания) на 24 ч при 4 ºС. Из фиксированного СМ, ориентируясь по корешкам, выделяли II грудной (TII) и IV поясничный (LIV) сегменты, которые замораживали в криогеле Tissue-Tek O. C. T. Compound (Sakura Finetek, Нидерланды). Из выделенных сегментов на криостате Shandon E (Thermo Scientific, Великобритания) готовили поперечные серийные срезы толщиной 14 мкм. Для выявления интернейронов использовали каждый 5-й из серийных срезов - всего 10 срезов каждого сегмента. Иммуногистохимически и морфометрически интернейроны изучали в вентральном роге и промежуточной зоне серого вещества СМ. Для определения их соответствия пластинам Рекседа [15] использовали схему [17] ламинарного строения серого вещества СМ у крыс (рис. 1). Выявление нервных клеток, ИР к КБ, проводили по ранее описанной методике с использованием меченых антител [1]: первичные антитела (Abcam, Великобритания) поликлональные кроличьи к КБ, разведение 1:500; вторичные ослиные антитела (Jackson ImmunoResearch Laboratories, США) к кроличьему иммуноглобулину G, конъюгированные с флюоресцеин-изотиоцианатом - FITC, разведение 1:200, флюоресцирующим в зеленой области спектра. Мечение всей популяции нейронов по Нисслю проводили красителем, флюоресцирующим в красной области спектра NeuroTrace Red Fluorescent Nissl Stains (Molecular Probes, США), разведение 1:200. После этого срезы отмывали в PBS и заключали в среду для иммунофлюоресценции VectaShield (Vector Laboratories, США). С целью контроля, для исключения неспецифической реакции, часть срезов инкубировали без первичных антител. Препараты анализировали, используя микроскоп Олимпус BX43 (Olympus Corporation, Япония), оснащенный соответствующим набором флюоресцентных фильтров-блоков. Изображения получали при помощи охлаждаемой цифровой видеокамеры TСC-5.0ICE (Tucsen, Китай). Измерение площади сечения ИР-интернейронов проводили по программе Image J (NIH, США) на изображениях срезов, полученных при объективе 20×/0,50. На этих же срезах подсчитывали число ИР-интернейронов в каждой пластине серого вещества СМ. Для определения средних арифметических значений и их стандартных ошибок использовали программу Statistica, версия 10 (StatSoft, Inc., 2011). Для поиска различий между средними применяли анализ вариаций ANOVA, различия считали значимыми при Р<0,05. Результаты исследования. В TII и LIV СМ КБ-ИР-интернейроны выявлены в промежуточной зоне и вентральном роге серого вещества. В промежуточной зоне СМ на обоих уровнях имеются 2 субпопуляции ИР-интернейронов, одна из которых представлена клетками, находящимися в дорсальной её части и вдоль пластины VII в виде цепочек, направляющимися от задней серой спайки до бокового рога серого вещества СМ в TII (рис. 2, в, клетки обозначены стрелками). В LIV эти клетки были расположены от задней серой спайки до латерального края серого вещества на границе пластин VII и V (см. рис. 2, а, клетки обозначены стрелками). ИР-нейроны данной субпопуляции имели вытянутую и треугольную форму тел, и располагались параллельно медиолатеральной оси. От тел клеток отходили 2-3 отростка, которые распространяясь в медиолатеральном направлении и переплетаясь с отростками соседних клеток, формировали клеточную цепочку. На поперечных срезах СМ в этой области в TII выявлялись от 3 до 5, в LIV - от 3 до 4 ИР-клеток на каждом срезе (таблица) Средняя площадь сечения данных КБ-ИР-интернейронов не превышала 100 мкм2, но в TII была больше, чем в LIV на 13% (см. таблицу). Вторая субпопуляция ИР-клеток, выявляемая в промежуточной зоне, топографически также соответствовала пластине VII на обоих уровнях СМ. Эти ИР-интернейроны располагались диффузно, как одиночно, так и образовывали в центральных областях пластины группы из 2-3 клеток (см. рис. 2, в, клетки обозначены квадратами). В медиальной области пластины VII, примыкающей к пластине Х, выявлялись исключительно одиночные клетки, которые находились на расстоянии 130 мкм (TII) и 190 мкм (LIV) от центрального канала (см. рис. 2, б, клетка обозначена квадратом). Данные ИР-интернейроны имели округлую форму тел, от которых к вентральному рогу отходили 3-4 радиальных отростка с максимальной протяженностью 140 мкм. В центральной области пластины VII тела интернейронов имели округлую и вытянутую форму, от них отходили 2-3 отростка, ориентированных дорсовентрально с максимальной протяженностью до 120 мкм в дорсальном направлении с проникновением в пластину V дорсального рога (см. рис. 2, в, клетка обозначена точкой). На поперечных срезах СМ в этой области в TII выявлялось от 2 до 3 ИР-клеток на каждом 2-м срезе, в LIV - от 3 до 7. Данная субпопуляция ИР-интернейронов имела среднюю площадь сечения более 100 мкм2 на обоих уровнях, но в LIV они были больше, чем в на 13%. В вентральном роге также определялись 2 субпопуляции ИР-интернейронов на обоих уровнях СМ, одна из которых располагалась на верхушке вентрального рога, что топографически соответствовало пластине IX (вентромедиальное ядро мотонейронов) в TII и вентральной области пластины VII в LIV. Характерной особенностью топографии данных интернейронов являлось их расположение у места выхода вентральных корешков (рис. 3, а), в зоне локализации мотонейронов пластины IX - вентромедиальных в TII и вентролатеральных в LIV (см. рис. 3, в). Тела КБ-ИР-интернейронов этой субпопуляции имели овальную форму, от них отходили 3-4 тонких отростка (см. рис. 3, б), ветви которых протяженностью до 70 мкм в TII и более длинные - до 120 мкм - в LIV, прослеживались в пластине IX: в TII - в вентральной области рога, где располагалось вентромедиальное ядро мотонейронов; в LIV - в латеральной и центральной областях вентрального рога, где располагались соответственно вентролатеральное и центральное ядра мотонейронов. Количество интернейронов вентрального рога на поперечных срезах СМ было различным: в TII выявлялись от 1 до 3, в LIV - от 1 до 8 ИР-клеток на каждом 2-м срезе. Средняя площадь сечения ИР-клеток не превышала 100 мкм2 ив TII была больше, чем в LIV на 16,5%. Вторая субпопуляция ИР-клеток вентрального рога была обнаружена в его медиальной области в TII, что топографически соответствовало пластине VIII (см. рис. 2, в, клетка обозначена кругом), и в его центральной области в LIV (см. рис. 3, в, г), что соответствовало пластине VII (см. рис. 1). Выявляемые КБ-ИР-интернейроны имели округлую форму тела, от которого отходили 3-4 коротких отростка. В TII ветви отростков не прослеживались, в LIV их протяженность достигала 50 мкм. Число КБ-ИР-интернейронов данной субпопуляции было минимальным: в TII единичные ИР-клетки выявлялись на каждом 3-м срезе СМ; в LIV 1-2 клетки - на каждом 4-м срезе. Средняя площадь сечения выявляемых ИР-клеток превышала 300 мкм2 ив LIV была больше, чем в TII на 65% (см. таблицу). Анализ морфометрических данных показал, что средняя площадь данной субпопуляция КБ-ИР-интернейронов превышала размеры КБ-иммунонегативных мотонейронов на 16,5% в TII и на 67% в LIV, средняя площадь которых была в TII - 305±10 мкм2, в LIV - 352±16 мкм2. Обсуждение полученных данных. Результаты проведенной работы доказывают гетерогенность КБ-ИР-интернейронов, располагающихся в грудных и поясничных сегментах СМ, в промежуточной зоне и вентральном роге серого вещества, а также в пределах пластин Рекседа. Об этом свидетельствуют форма, количество отростков, их длина и распространенность, площадь сечения, число интернейронов, содержащих КБ. Топография КБ-ИР-интернейронов промежуточной зоны TII СМ позволяет отнести группу клеток вытянутой и треугольной формы с площадью сечения менее 100 мкм2, распределенную от задней серой спайки до бокового рога серого вещества, к симпатическим преганглионарным нейронам, которые формируют на протяжении пластины VII промежуточно-латеральное автономное ядро, состоящее из основной части ядра, расположенной в боковом роге, центрального ядра, расположенного дорсально от центрального канала, и вставочного ядра, расположенного между основной частью и центральным ядром [7, 8]. Аналогичные по топографии, форме КБ-ИР-интернейроны определяются и на уровне СМ, в котором у крысы также выявляются симпатические преганглионарные нейроны [5]. Субпопуляцию КБ-ИР-интернейронов медиальной и центральной областей промежуточной зоны, представленную округлыми и вытянутыми клетками с отростками, направленными как к дорсальному и вентральному рогам, так и радиально, с площадью тела более 100 мкм2 следует отнести к «разделительным» клеткам (partition cells), которые образуют ипсилатеральные соединения с мотонейронами вентрального рога, интернейронами дорсального рога и первичными афферентными нейронами [5, 18]. Полифункциональность интернейронов пластины VII связывают с их глутамат-и глицин-специфичностью, а также с сочетанной локализацией γ-миномасляной кислоты и глицина [12]. Некоторые авторы относят их к комиссуральным интернейронам, радиально направленные отростки которых образуют соединения с контралатерально расположенными нейронами [11]. Субпопуляции КБ-ИР-интернейронов вентрального рога существенно отличаются от субпопуляций в промежуточной области. Одни клетки располагаются на верхушке вентрального рога как в TII, так и в LIV, в пластинах IX и VII, соответственно. Площадь сечения их тел не превышает 100 мкм2, а отростки достигают ядер мотонейронов как в TII, так и в LIV. Локализация и размеры клеток, распространение отростков служат основанием [3] для отнесения их к той субпопуляции интернейронов вентрального рога, которые именуются клетками Реншоу и обеспечивают ипсилатеральное моносинаптическое торможение мотонейронов [2, 9]. Сегментарные особенности их количественного представительства и локализации в пластинах Рекседа связаны с изменчивостью топографии ядер мотонейронов [16], сопряженных в TII с эпаксиальной и в LIV с гипаксиальной мускулатурой. По топографии, отличающейся от локализации ядер мотонейронов в пластинах IX, размерам, характеристике отростков крупные единичные КБ-ИР-нейроны пластин VIII в TII и VII в LIV вентрального рога СМ, выявленные в проведенном исследовании, следует отнести не к мотонейронам, а к интернейронам, тем более, что α-мотонейроны не проявляют иммунореактивность к КБ у взрослых животных [4, 13]. Это совпадает с данными ряда исследователей, относящих такие нейроны к крупным мультиполярным интернейронам, выполняющим премоторную функцию [14]. Наличие механизма индукции КБ в этих клетках также сближает их как с клетками Реншоу [10], так и с интернейронами промежуточной зоны.

About the authors

V. V. Porseva

Yaroslavl’ State Medical Academy

Email: vvporseva@mail.ru

References

Supplementary files