DISTRIBUTION OF GABAERGIC NEURONS IN PNEUMOTAXIC CENTER NUCLEI IN THE EARLY POSTNATAL PERIOD IN NORM AND IN PRENATAL DEFICIENCY OF SEROTONINERGIC SYSTEM IN RATS

全文:

Пневмотаксический центр включает симметричные структуры дорсолатеральной области моста - медиальное субъядро медиальной части парабрахиального комплекса и ядро Кëлликера- Фюзе и представляет собой структурнофункциональный нейронный комплекс, функция которого связана с регуляцией активности нейронов дыхательного центра и генерацией дыхательного ритма [11, 13]. Механизмы генерации и регуляции дыхательного ритма у млекопитающих начинают формироваться в конце пренатального периода, при этом известно, что структуры, участвующие в становлении респираторной функции, уже на ранних стадиях развития получают иннервацию от различных моноаминергических систем, в том числе серотонинергической [8, 9]. Показано, что в пренатальный период серотонин принимает участие в формировании субъядер парабрахиального комплекса и модулирует процессы созревания нейронов, а впоследствии способен к организации и регуляции различных параметров деятельности этих структур [2-4, 8]. Парабрахиальная область, в частности ее медиальная часть, и ядро Кëлликера-Фюзе у взрослых животных имеют обширную иннервацию, которая обеспечивается в основном нейронами каудальных ядер серотонинергической системы [2, 8]. Другая нейротрансмиттерная тормозная ГАМК-ергическая система также играет важную роль в осуществлении респираторных функций, которые опосредуются рядом стволовых структур и пневмотаксическим центром. В результате физиологических экспериментов установлено, что у взрослых млекопитающих ГАМК-ергические нейроны пневмотаксического центра, оказывая тормозное влияние на инспираторные нейроны ядер дыхательного центра и мотонейроны диафрагмального ядра, способны осуществлять ритмическую смену фаз дыхательного цикла [5]. При этом, ядра пневмотаксического центра сами получают афферентные тормозные ГАМК-ергические проекции [6]. Медиальное субъядро парабрахиального комплекса и ядро Кëлликера-Фюзе имеют как структурные, так и функциональные особенности, однако, в какой степени они являются объектами ГАМК-ергического торможения на ранних этапах постнатального развития, известно мало, а вопрос о влиянии недостаточности серотонинергической системы в пренатальный период на ГАМК-ергическую иннервацию структур пневмотаксического центра практически не изучался. Установлено, что ГАМК синтезируется из глутаминовой кислоты при участии фермента глутаматдекарбоксилазы, представленного двумя изоформами, имеющими молекулярную массу 65 килодальтон (GAD65) и 67 килодальтон (GAD67) [7]. Иммуногистохимическим методом показано, что GAD65 присутствует в терминалях аксонов, тогда как GAD67 - во всем нейроне, т. е. в теле, дендритах, аксонах, терминальных отростках и поэтому широко используется как маркер ГАМКергических нейронов [9]. Цель данной работы - изучение распределения ГАМК-ергических нейронов в структурах пневмотаксического центра (медиальном субъядре медиальной части парабрахиального комплекса и ядре Кëлликера-Фюзе) у крыс в норме и при недостаточности серотонинергичесой системы в пренатальный период развития. Материал и методы. Работа выполнена на лабораторных крысах линии Вистар. Содержание животных и все экспериментальные процедуры проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Для снижения в организме содержания эндогенного серотонина использовали метод ингибирования триптофангидроксилазы (фермента его синтеза) парахлорфенилаланином (пХФА) (Sigma, США). пХФА в дозе 400 мг/кг самкам крыс (n=6) вводили внутрибрюшинно на 16-е сутки беременности, в период формирования собственной серотонинергической системы у плодов [1]. Показано, что в этой дозе как у взрослых животных, так и у развивающихся плодов, пХФА вызывает длительное снижение содержания эндогенного серотонина (до 50-80%) [10, 12]. Головной мозг у крысят исследовали в раннем постнатальном (5-, 10-, 12-е сутки) и ювенильном возрасте (20-е сутки). В качестве контроля использовали животных соответствующих сроков развития, полученных от интактных самок (n=5). В каждый срок исследования было взято по 5-6 как подопытных, так и контрольных крысят. Материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде на фосфатно-солевом буфере (рH 7,4), заливали в парафин по общепринятой методике и готовили серийные поперечные срезы области моста толщиной 4-5 мкм на уровне Брегма -8,88-9,12 мм. Иммуноцитохимическую реакцию для выявления GAD67 проводили с использованием кроличьих поликлональных антител (Spring Bioscience, США). В качестве вторичных реагентов для GAD-67 использовали реактивы из набора EnVision+System-HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit (DakoCytomation, США). Для визуализации продукта реакции пользовались хромогеном DAB+ (Dako, Дания). После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов докрашивали гематоксилином Майера (Bio-Optica, Италия) или тионином (Serva, США, Германия) и заключали в синтетическую среду Permaunt (Termo, США). Условия проведения иммуноцитохимической реакции были стандартизированы, все процедуры при иммуноокрашивании гистологических срезов, полученных от контрольных и подопытных животных, осуществляли одновременно. На цифровых изображениях серийных срезов, полученных при помощи светового микроскопа Leica DME (Leica, Германия) и цифровой камеры Leica EC3 (Leica, Германия), подсчитывали (при об. 100, ок. 10 на стандартной площади) число GAD-67-иммунопозитивных нейронов медиального субъядра медиальной части парабрахиального комплекса и ядра Кëлликера-Фюзе, визуально определяли плотность сплетения терминальных отростков в нейропиле, плотность расположения зерен (предположительно синапсов и их скоплений соответственно [6]). Статистическую обработку полученных показателей осуществляли при помощи пакета прикладных компьютерных программ Statistica 6.0., ImageScope Color и ORIGIN50. Значимость различий определяли по величине t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при Р<0,05. Результаты исследования. Ядро Кëлликера-Фюзе. У 5-суточных интактных крысят на срезах ядра не обнаружено меченых нейронов. В нейропиле иммунопозитивные сплетения терминальных отростков практически не определялись. На 10-е сутки на срезе ядра присутствовали 5,0±0,3 нейрона со слабо иммунопозитивной цитоплазмой. В нейропиле выявлялись иммунопозитивные слабо окрашенные сплетения терминальных отростков и мелкие зерна. Часто встречались крупные интенсивно окрашенные иммунопозитивные гранулы, они присутствовали как в нейропиле, так и на поверхности неокрашенных нейронов (рис. 1, а). На 12-е сутки в нейропиле значительно возрастает количество иммунопозитивных интенсивно окрашенных мелких зерен и гранул. На 20-е сутки на срезе ядра присутствуют 6,0±1,4 иммунопозитивных нейрона с интенсивно окрашенной цитоплазмой. В нейропиле повышается интенсивность иммунной окраски сплетений терминальных отростков (см. рис. 1, б). Значительно увеличивается количество иммунопозитивных интенсивно окрашенных крупных гранул. Они встречаются в нейропиле, на поверхности как окрашенных, так и неокрашенных нейронов (в количестве от 4 до 8 на клетку). У 5-суточных экспериментальных животных на срезах ядра Кëлликера-Фюзе меченые нейроны и иммунопозитивные сплетения терминальных отростков в нейропиле не определялись. На 10-е сутки на срезе ядра присутствовали 3,0±0,3 нейрона со слабо иммунопозитивной цитоплазмой. В нейропиле выявлялись рыхлая иммунопозитивная слабо окрашенная сеть терминальных отростков, редкие мелкие зерна и единичные более крупные иммунопозитивные интенсивно окрашенные гранулы. На 12-е сутки морфологическая картина соответствовала таковой предыдущего срока исследования. На 20-е сутки на срезах ядра присутствовали 6,0±1,7 меченых нейрона. В нейропиле слабо иммунопозитивные терминальные отростки образовывали сплетения, здесь же имелись иммунопозитивные мелкие зерна (см. рис. 1, в). Иммунопозитивные интенсивно окрашенные гранулы (в количестве 2-4 на клетку) присутствовали на поверхности неокрашенных нейронов и нейропиле. Таким образом, у интактных животных в более ранние сроки постнатального развития (5-е сутки) GAD-67-синтезирующие нейроны не выявляются. К 10-м суткам в ядре Кëлликера-Фюзе появляется популяция GAD-67-экспрессирующих нейронов, численность которой сохраняется к ювенильному возрасту (20-е сутки). При этом, с увеличением постнатального возраста усиливается интенсивность иммунной реакции цитоплазмы нейронов и сети терминальных отростков, увеличивается количество иммунопозитивных зерен и гранул. Сниженное содержание в организме серотонина в пренатальный период приводит к уменьшению количества GAD-67-экспрессирующих нейронов в ранние постнатальные сроки, однако к ювенильному возрасту их число возрастает и достигает контрольного значения, однако плотность расположения мелких зерен и крупных гранул остается сниженной. Медиальное субъядро медиальной части парабрахиального комплекса. У 5-суточных интактных крысят на срезах субъядра иммунопозитивные нейроны и терминальные отростки не выявлялись. На 10-е сутки на срезах субъядра обнаруживались 2,0±0,4 нейрона, содержащих GAD-67, при этом иммунная реакция цитоплазмы была слабой. В нейропиле встречалось мало иммунопозитивных терминальных отростков, мелких зерен, а также интенсивно окрашенных гранул, которые располагались преимущественно на поверхности неокрашенных нейронов (рис. 2, а). На 12-е сутки на срезе присутствовали 3,0±0,9 нейрона со слабо выраженной иммунной реакцией цитоплазмы. В нейропиле сеть иммунопозитивных терминальных отростков стала плотнее по сравнению с таковой в предыдущий срок исследования. Иммунопозитивных зерен и гранул также стало больше, они распределялись в нейропиле диффузно и находились на поверхности неокрашенных нейронов. На 20-е сутки на срезе медиального субъядра выявлялись 3,0±1,0 GAD-67экспрессирующих нейрона со слабо окрашенной цитоплазмой. В нейропиле иммунопозитивные терминальные отростки образовывали плотное сплетение. Плотность расположения иммунопозитивных мелких зерен и гранул увеличивалась, повышалось количество гранул, находящихся на поверхности неокрашенных нейронов (см. рис. 2, б). У 5-суточных экспериментальных крысят, так же как и у интактных, на срезах субъядра иммунопозитивных нейронов и терминальных отростков обнаружено не было. На 10-е сутки на срезе присутствовали 2,0±0,10 нейрона со слабо выраженной иммунной реакцией цитоплазмы. В нейропиле иммунопозитивные слабо окрашенные терминальные отростки образовывали рыхлые сплетения, здесь же выявлялись мелкие бледно окрашенные зерна. Крупные гранулы отсутствовали. На 12-е сутки морфологическая картина не отличалась от таковой в предыдущий срок исследования. На 20-е сутки на срезе присутствовали 2,0±0,10 нейрона, содержавшие GAD-67 и имевшие слабо окрашенную цитоплазму. В нейропиле сплетение иммунопозитивных терминальных отростков стало более плотным, чем в предыдущий срок исследования. Присутствовали мелкие бледно окрашенные зерна, при этом появлялись одиночные крупные иммунопозитивные гранулы. Они были диффузно рассеяны в нейропиле (см. рис. 2, в). Таким образом, в медиальном субъядре парабрахиального комплекса у интактных крыс в ранние постнатальные сроки развития нейронов, экспрессирующих GAD-67, было меньше, чем в ядре Кëлликера-Фюзе, а также значительно ниже была плотность сплетений иммунопозитивных терминальных отростков и расположения зерен и гранул. К ювенильному возрасту происходило увеличение числа GAD-67-синтезирующих нейронов (почти в 2 раза), терминальные отростки в нейропиле образовывали более плотную сеть, увеличивалась плотность расположения зерен и гранул, однако оставаясь значительно ниже, чем в ядре Кëлликера-Фюзе. У животных, развивавшихся при сниженном содержании серотонина, в пренатальный период число GAD-67синтезирующих нейронов с возрастом практически не повышалось, и интенсивность иммунной реакции оставалась слабой, однако в нейропиле сплетение иммунопозитивных терминальных отростков становилось плотнее, увеличивалось количество мелких зерен, и появлялось незначительное количество крупных гранул. Обсуждение полученных данных. Результаты исследования показали, что у интактных (контрольных) и подопытных животных в ядрах пневмотаксического центра элементы тормозной ГАМК-ергической системы, вероятно, появляются после 5-х суток постнатального периода развития. К 10-м суткам в ядре Кëлликера-Фюзе уже присутствует популяция ГАМК-ергических нейронов, численность которой сохраняется к ювенильному возрасту. При этом, интенсивность иммунной реакции постепенно повышается как в цитоплазме нейронов, так и в терминальных отростках в нейропиле. Увеличивается также плотность сплетений терминальных отростков и плотность ГАМКергических синапсов и их скоплений. Считают, что выявляемые в нейропиле сплетения иммунопозитивных терминальных отростков, зерна и крупные гранулы принадлежат ГАМК-ергическим афферентным проекциям [6]. В медиальном субъядре парабрахиального комплекса тормозная ГАМК-ергическая система в ранний постнатальный период представлена в меньшей степени, чем в ядре Кëлликера- Фюзе. К 10-м суткам присутствует незначительное число ГАМК-ергических нейронов, которое к ювенильному возрасту удваивается, однако сохраняется слабая иммунная реакция цитоплазмы этих нейронов. В нейропиле интенсивность окрашивания иммунопозитивных терминальных отростков повышается незначительно, однако, увеличивается плотность их сплетения, а также возрастает плотность расположения ГАМК-ергических синапсов и их скоплений. Число ГАМК-ергических нейронов, их отростков и плотность расположения синапсов остаются значительно ниже, чем в ядре Кëлликера-Фюзе. Вероятно, более выраженная ГАМК-ергическая иннервация ядра Кëлликера- Фюзе обусловливает его функциональную значимость в ранние сроки постнатального развития. Ядра пневмотаксического центра являются мишенями обширных ГАМК-ергических афферентных проекций, источник которых до сих пор не установлен. Несмотря на то, что во многих областях продолговатого мозга у крыс ГАМКергические интернейроны присутствуют в большом количестве, структуры, обеспечивающие тормозные проекции на медиальное субъядро парабрахиального комплекса и ядро Кëлликера- Фюзе, не идентифицированы [6], так же как и не определено большинство мишеней эфферентных проекций ГАМК-ергических нейронов, присутствующих в ядрах пневмотаксического центра [6]. Наблюдаемое в ядрах пневмотаксического центра повышение с возрастом плотности расположения иммунопозитивных терминальных отростков, зерен и гранул в нейропиле может происходить как за счет увеличения подрастающих ГАМК-ергических афферентных терминалей, так и за счет отростков и их терминалей возрастающего числа ГАМК-ергических нейронов в исследуемых ядрах, осуществляющих, таким образом, тормозной контроль нейронов центра как извне, так и своей локальной ГАМК-ергической сетью. Вероятно, функциональная деятельность пневмотаксического центра находится под значительным тормозным контролем ГАМК-ергической системы с ранних сроков постнатального развития. Полученные результаты показали, что по сравнению с контролем дефицит серотонина в пренатальный период приводит к снижению числа ГАМК-ергических интернейронов в ядре Кëлликера-Фюзе в ранние сроки постнатального развития, которое, однако, к ювенильному возрасту постепенно повышается и достигает такового у контрольных животных. При этом, интенсивность окрашивания цитоплазмы иммунопозитивных нейронов, терминальных отростков, плотности расположения синапсов и их скоплений остается пониженной. Дефицит серотонина в пренатальный период развития в медиальном субъядре медиальной части парабрахиального комплекса также приводит к сокращению числа ГАМК-ергических интернейронов в раннем постнатальном и ювенильном возрасте, снижению экспрессии GAD-67 в терминальных отростках, уменьшению плотности расположения ГАМК-ергических синапсов и их скоплений по сравнению с контролем. Таким образом, результаты исследования могут свидетельствовать о том, что снижение содержания серотонина в пренатальный период развития вызывает нарушение тормозной афферентации ядер пневмотаксического центра и изменение локальных тормозных ГАМК-ергических сетей в его ядрах, что в результате может приводить к нарушению тормозных процессов в структурах центра. Полученные данные дают возможность лучше понять причины возникновения тяжелых заболеваний в неонатальном и детском возрасте, связанных с нарушением респираторной функции.

作者简介

L. Khozhai

I. P.Pavlov Institute of Physiology

Email: astarta0505@mail.ru

参考

补充文件