THE DYNAMICS OF QUANTITATIVE PARAMETERS OF RAT ADRENAL MEDULLA AFTER ITS PARTIAL LASER DESTRUCTION

Full Text

Лазерная хирургия, ставшая одним из значительных достижений современной медицины, применяется с каждым годом всё более активно. Между тем, реакция тканей и органов на лазерное повреждение (ЛП) всё ещё остаётся недостаточно изученной [14]. Сказанное в полной мере относится к надпочечнику, лазерная хирургия которого имеет уже более чем двадцатипятилетнюю историю [2] и успешно применяется в настоящее время [13]. Фундаментальным исследованиям гистологических характеристик состояния надпочечника после ЛП посвящена серия публикаций, однако полученные данные неполны [4, 6, 7]. Показано, что ЛП вызывает коагуляционный некроз, приводящий к распаду паренхимы и замещение её рубцовой тканью. При этом, если хотя бы 1/3 паренхимы оказывается вне зоны поражения, то она не только выживает, но и, отграничиваясь от повреждённой части, постепенно принимает нормальный вид. Объективная оценка выраженности деструктивных и регенеративных процессов в выжившей части надпочечника представляет не только теоретический, но и практический интерес и может быть проведена с использованием морфометрического метода раздельно для коркового и мозгового вещества надпочечника (МВН). Данная работа посвящена экспериментальному изучению динамики количественных показателей части МВН, выжившей после ЛП. Материал и методы. Исследование выполнено на 41 крысе-самце линии Вистар массой 372±40 г, из которых у 36 под хлороформным наркозом проведена лазерная деструкция части левого надпочечника; 5 интактных крыс служили контролем. Для ЛП применён диодный хирургический лазерный аппарат «Лами» (Опттехника, Россия) со стандартными для паренхиматозных органов параметрами: длина волны 1020 нм, мощность излучения 2,5 Вт, световод диаметром 400 мкм, 150 импульсов по 190 мс с интервалом в 10 мс (энергия воздействия 71,25 Дж). Объём испарённой ткани составил 0,30±0,10 мм3 при объёме надпочечника в момент повреждения 10,0±2,5 мм3. На 1-, 7-, 14-, 21-, 28-еи 56-е сутки парами эфира производили эвтаназию по 5-7 животных на временную точку и взятие надпочечников. Обращение с животными соответствовало «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г.). Для дифференцировки в МВН двух основных субпопуляций хромаффиноцитов - адреналоцитов и норадреналоцитов применяли метод L. H. Honore [9], согласно которому материал фиксировали в глутаральдегиде, заливали в парафин, а срезы окрашивали бихроматом калия - толуидиновым синим. В результате норадреналоциты приобретали зелёный, а адреналоциты - серовато-фиолетовый цвет. Морфометрию проводили стереологическим методом [3] с учетом подходов, разработанных при оценке механизмов постнатального роста хромаффинной ткани надпочечника [8]. В выжившей части МВН - органов, сохранивших после ЛП, не менее 1/3 паренхимы, стереологическим методом «полей» [1] на случайных срезах были определены относительные объемы (объемные доли) адреналоцитов и норадреналоцитов (вместе и раздельно), кровеносных сосудов, соединительнотканной стромы и нейронов (об. 40, ок. 7, бинокулярная насадка 1,5, окулярная вставка с 60 равноуда ленными точками). Средние площади сечения адреналоцитов и норадреналоцитов определяли путём обведения периметров клеток в программе ImageJ (дистрибьютив Fiji, открытое ПО) на цифровых фотографиях случайных срезов (об. 40, ок. 10). Статистическую обработку проводили с помощью программ УГС 2.0 [5] и Microsoft Excel. Различия измеряемых структур оценивали по t-критерию Стьюдента и считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. Анализ динамики соотношения основных тканевых компонентов МВН после ЛП (рис. 1, а) показал, что относительный объем кровеносных сосудов на 7-е сутки достигает максимального значения (37±5%; P<0,01 по сравнению с контролем), затем плавно снижается (P<0,01 по сравнению с 7-ми сутками и контролем) до минимума (18,0±0,7%) на 28-е сутки. К 56-м суткам данный показатель нормализуется (26,0±2,1%, P>0,05 по сравнению с контролем). Объемные доли хромаффиноцитов в целом и отдельно субпопуляции адреналоцитов на 1-е сутки - 54±4% и 48±3% значимо не отличаются от контрольных значений - 58±5 и 46±3% соответственно (P>0,05). К 7-м суткам величины этих показателей снижаются до 50±4 и 41±3% (P<0,05 по сравнению с контролем и на 1-е сутки), а на 28-е сутки - достигают максимальных значений - 71,2±1,5 и 63,4±1,9% (P<0,01 по сравнению с таковыми на 7-е сутки и с контролем). Относительный объем субпопуляции норадреналоцитов через 1 сут после ЛП снижается до 5,7±0,9% (P<0,01 по сравнению с контролем; 11,9±2,1%), к 7-м суткам данный показатель увеличивается до 8,8±1,6% и остаётся неизменным до конца наблюдения, не достигая при этом уровня контроля (P<0,05). Доля стромы, составлявшая в начале наблюдения 12,9±2,2%, значимо не меняется в течение всего изученного 2-месячного периода и не отличается от контроля (13±4%; P>0,05). Значимых изменений относительных объемов нейронов по сравнению с контрольными значениями в эксперименте также не зарегистрировано (P>0,05). Показательна динамика соотношения объемных фракций «хромаффиноциты/строма» (рис. 2, а, б). На 1-е сутки оно не отличается от контроля (4,2 и 4,3 соответственно), затем плавно увеличивается, достигая на 28-е сутки максимального значения (6,6); к 56-м суткам этот показатель снижается (5,1), но так и не нормализуется. Необходимо учесть, что рост или уменьшение доли одного компонента автоматически уменьшает или увеличивает доли других, даже если реальных изменений они не претерпевают. Однако если бы после ЛП в выжившей части МВН реально менялся только объём кровеносных сосудов, то соотношение «хромаффиноциты/строма» (очень малой долей нейронов можно пренебречь) должно было бы оставаться стабильным на протяжении всего эксперимента. Таким образом, изменение соотношения «хромаффиноциты/строма» в пользу стромы означает, что уменьшение доли хромаффиноцитов не пропорционально ответу на увеличение доли сосудов и вскрывает реальную убыль, т. е. гибель и распад хромаффиноцитов за пределами зоны поражения (рис. 3, а, б). Аналогично изменение соотношения «хромаффиноциты/строма» в пользу эндокринных клеток выявляет реальный прирост хромаффинной ткани, т.е. процесс её восстановительной регенерации за счёт гиперплазии (см. рис. 3, в) и гипертрофии. Из этого следует, что если разницу между долями хромаффиноцитов в данный срок эксперимента и в контроле скорректировать на величину, обусловленную только динамикой доли кровеносных сосудов, то можно оценить реальный масштаб убыли или прироста доли хромаффинной ткани. Долю хромаффиноцитов, обусловленную только динамикой сосудов, можно вычислить, если от разницы между долями сосудов в контроле и в данный срок эксперимента оставить только часть, пропорциональную «эталонному» соотношению «хромаффиноциты/строма» в контроле. Исходя из сказанного, можно составить следующую формулу: где YφANi - доля реального прироста (при отрицательном значении - доля реальной убыли) хромаффиноцитов в данный срок эксперимента, - доля хромаффиноцитов в данный срок φANiэксперимента, φANctrl - доля хромаффиноцитов в контроле, φVctrl - доля кровеносных сосудов в контроле, φVi - доля кровеносных сосудов в данный срок эксперимента, φSctrl - доля стромы в контроле. В результате выявляется, что на 1-е сутки реальная убыль хромаффиноцитов составляет 0,3%, ак 7-м суткам достигает уже 1,5%. После 7-х суток убыль сменяется приростом. До 14-х суток скорость прироста - около 1% в неделю, ас 14-х до 28-х суток - 2-2,5% в неделю. К 28-м суткам реальный прирост хромаффиноцитов достигает максимума в 4,7%, затем начинает снижаться и к 56-м суткам составляет уже 2% (см. рис. 2, б). Средняя площадь сечения хромаффиноцитов (в расчете на всю популяцию) уже через 1 сут после ЛП составляет 111±6 мкм2, что на 20% больше, чем в контроле (93±6 мкм2, P<0,01). До конца 1-го месяца отмечены 2 пика дальнейшего роста данного показателя на 14-еи 28-е сутки (120,9±1,4 и 130,1±2,5 мкм2 соответственно; P<0,01). К 56-м суткам происходит уменьшение показателя до 107±4 мкм2 (увеличиваясь на 15% по сравнению с контролем, P<0,05). Средняя площадь сечения адреналоцитов возрастает через 1 сут до 122±8 мкм2 по сравнению с контролем (100±9 мкм2, P<0,01), стабилизируется на этом уровне до 21-х суток (P>0,05 по сравнению с таковой на 1-, 7-еи 14-е сутки) и достигает максимума к 28-м суткам опыта (149±4 мкм2, P<0,01 по сравнению с показателем на 21-е сутки). К 56-м суткам размеры адреналоцитов снижаются до 120±6 мкм2, однако остаются незначимо (на 20%) больше, чем в контроле (P>0,05). На 1-е сутки превышают уровень контроля (85±7 мкм2) и средние размеры норадреналоцитов - (95±6 мкм2, P<0,01). К 14-м суткам данный показатель возрастает до 111±6 мкм2 (по сравнению с таковым на 1-е сутки - P<0,01 и на 7-е сутки - P<0,05). Затем до 21-х суток этот показатель стабилен, составляя 105±8 мкм2 (P>0,05 по сравнению с показателем на 14-е сутки), ак 28-м суткам вновь увеличивается, достигая максимума в 115,5±0,4 мкм2 (P<0,05 по сравнению с таковым на 21-е сутки). К 56-м суткам (см. рис. 1, б) средние размеры норадреналоцитов нормализуются (87,5±1,3 мкм2; P>0,05 по сравнению с контролем). Соотношение адреналоцитов и норадреналоцитов во все сроки эксперимента оказалось значительно ниже контрольного: в среднем 87,1±2,6 и 12,9±2,6% - 79,7±2,2 и 20,3±2,2% соответственно (P<0,01). Наиболее существенные различия на 1-е сутки после ЛП: 89,5±0,9 и 10,5±0,9% соответственно (P<0,01 по сравнению с контролем). Обсуждение полученных данных. Динамика объёма каждого тканевого компонента МВН имеет свою специфику. Для хромаффиноцитов она, в первую очередь, определяется изменением их количества и размеров, для волокнистой соединительной ткани - состоянием её межклеточного вещества. Динамика объема кровеносных сосудов в краткосрочном периоде тесно связана с изменением их просвета под действием кровяного давления и кровенаполнения, а в отдалённые сроки - и с их новообразованием или разрушением. Следует отметить, что при ЛП важную роль играет величина кровотока через сосудистую сеть органа [12], которая в надпочечнике является одной из самых высоких в организме [11]. Увеличение доли кровеносных сосудов по сравнению с контролем в МВН и динамика этого показателя хорошо соотносятся с данными гистологического описания надпочечника после ЛП [4, 6, 7]. На 7-е сутки, когда доля сосудов достигает максимума, приходится и пик величины надпочечника в целом. Наиболее вероятной причиной роста доли сосудов в МВН в течение 1-й недели после ЛП является увеличение их кровенаполнения вследствие закупорки кровотока лазерным струпом и развивающейся воспалительной реакции. По мере распада лазерного струпа, образования новых сосудов в повреждённой части и снижения остроты воспалительной реакции кровоток нормализуется, и доля сосудов в неповреждённой части МВН плавно снижается. Выявленная реальная убыль хромаффиноцитов хорошо согласуется с данными гистологического исследования. Согласно им, гибнущие клетки в выжившей после ЛП части МВН встречаются вплоть до конца 1-й недели после воздействия [7]. Уменьшение реального прироста хромаффиноцитов после достижения пиковых значений на 28-е сутки, очевидно, связано с торможением пролиферации эндокриноцитов и уменьшением их размеров на фоне роста соединительной ткани, что необходимо для возвращения соотношения «хромаффиноциты/строма» к исходному (контроль) значению, т.е. для нормального функционирования хромаффинной ткани. Тот факт, что соотношение адреналоцитов и норадреналоцитов на 1-е сутки эксперимента существенно сдвигается в пользу адреналоцитов, а доля хромаффиноцитов, в целом, в это время не отличается от контрольной, свидетельствует о том, что ЛП вызывает не избирательную гибель одного из видов клеток, а изменение процессов синтеза и накопления норадреналина и адреналина. Это согласуется с данными гистологического исследования [6], показывающими, что непосредственно после ЛП (0-е сутки) в МВН окраска по L. H. Honore, основанная на свойстве глутаральдегида избирательно взаимодействовать с норадреналином в составе секреторных гранул [10], не позволяет отдифференцировать норадреналоциты от адреналоцитов. Так как размеры норадреналоцитов, составляющих 80-90% всей популяции хромаффиноцитов, стабильны до 21-х суток, реальный прирост доли хромаффинной ткани в этот период можно объяснить в основном увеличением количества клеток. На 28-е сутки размеры адреналоцитов и норадреналоцитов и доля хромаффиноцитов максимальны, что свидетельствует о существенном вкладе клеточной гипертрофии в увеличение объёма паренхимы и достижение ею максимального прироста в данный период. Выявленный уровень прироста хромаффинной ткани в зоне выживания достаточен для быстрого восполнения погибших эндокриноцитов в этой области, но из-за торможения в поздние сроки он не сказывается заметным образом на увеличении абсолютного объёма всей неповреждённой части МВН. В результате, как и следует из гистологического исследования, выжившая часть надпочечника сохраняет прежнюю структуру, а орган после сокращения пораженной части принимает форму, соответствующую усечённой исходной [4]. В целом, динамика количественных показателей основных тканевых компонентов зоны выжившей части МВН свидетельствует о её нормализации к концу 2-го месяца после ЛП.

About the authors

K. G. Kemoklidze

Yaroslavl’ State Medical Academy

Email: K_G_K@mail.ru

N. A. Tiumina

Yaroslavl’ State Medical Academy

Email: Natellamail@mai.ru

References

Supplementary files