SIMULTANEOUS DEMONSTRATION OF GLUTAMATE DECARBOXYLASE AND SYNAPTOPHYSIN IN PARAFFIN SECTIONS OF RAT CEREBELLUM



Cite item

Full Text

Abstract

The article presents highly reproducible and inexpensive protocol for simultaneous demonstration of glutamate decarboxylase (GAD67), the key enzyme of gamma-aminobutyric acid (GABA) synthesis and synaptophysin (SYP), a marker protein of synaptic vesicles using confocal laser microscopy. In the cerebellar cortex, GAD labels Purkinje cells and pinceaux in their basal parts and is unevenly distributed in the neuropil of molecular and granular layers. SYP clearly marks the contours of large dendrites of Purkinje cells in molecular layer, while in the granular layers it labels parts of cerebellar glomeruli - the terminals of the mossy fibers. GAD-immunopositive structures (GABA-ergic axons of stellate cells - Golgi cells) are often located at periphery of the glomeruli. In the peripheral zone of the glomeruli, colocalization of GAD- and SYP-immunopositive structures was observed, suggesting the presence of GABA-ergic synapses in this zone.

Full Text

Современные методы иммуноцитохимии позволяют проводить селективное маркирование синаптических белков и видеть крупные синапсы на уровне световой микроскопии [2]. Однако медиаторная принадлежность выявляемых синапсов требует уточнения. Для этого могут быть использованы методы двойного иммуноцитохимического маркирования [3]. В этом случае наиболее информативными являются исследования, проводимые с применением конфокальной лазерной микроскопии, поскольку они дают возможность независимого выявления двух различных флюорохромов и более, локализованных в одной микроструктуре изучаемого препарата. Применение двойного иммуноцитохимического маркирования и конфокальной микроскопии является необходимым условием для адекватного анализа солокализации синаптических и медиаторных маркеров. Такой подход позволяет судить не только о структурной организации синаптического аппарата, но и о медиаторной принадлежности выявляемых нервных окончаний. Несмотря на то, что рядом авторов [1, 8] опубликованы работы, свидетельствующие о возможности выявления глутаматдекарбоксилазы (ГДК) - ключевого фермента синтеза γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) [6] - на уровне различных звеньев рефлекторных дуг мозжечка у лабораторных животных, до сих пор отсутствует универсальный подход, позволяющий анализировать синаптический аппарат в архивном материале, хранящемся длительное время в парафиновых блоках. Этот методический пробел существенно уменьшает возможности исследователя анализировать ранее полученный экспериментальный материал и проводить ретроспективные нейробиологические исследования мозжечка сравнительного характера. Цель настоящего исследования состояла в разработке хорошо воспроизводимого протокола, позволяющего с минимально возможными трудозатратами и экономически оправданным использованием дорогостоящих реагентов эффективно определять совместную локализацию ГДК и синаптофизина - маркерного белка синаптических пузырьков [7], а также выявлять у крысы клубочки мозжечка - органоспецифические синаптические комплексы [9]. В работе использованы парафиновые блоки коры мозжечка половозрелых крыс-самцов линии Вистар (n=5) из архива лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы Института экспериментальной медицины. Материал был фиксирован в цинкэтанол-формальдегиде [5], обезвожен и залит в парафин по общепринятой методике. Из архивных блоков готовили срезы толщиной 5 и 10 мкм и наклеивали их на предметные стекла с адгезивным покрытием - «Polysine» (Menzel, Германия). Для выявления синаптофизина применяли мышиные моноклональные антитела к синаптофизину (клон SY38, Dako, Дания). ГДК выявляли с использованием кроличьих поликлональных антител к изоформе фермента GAD67 (Spring Bioscience, США). В качестве вторичных реагентов применяли биотинилированный антимышиный Fab-фрагмент иммуноглобулинов осла (Jackson ImmunoResearch, США), стрептавидин, конъюгированный с флюоресцентным красителем Cy2 (Jackson ImmunoResearch, США), и антикроличьи иммуноглобулины свиньи, связанные с тетраметилродаминизотиоцианатом (TRITC, Dako, Дания). В результате применения различных режимов инкубации срезов и подбора вариантов разведения реагентов был разработан оптимальный (по соотношению трудозатрат, объемов использованных реагентов и качеству получаемых препаратов) протокол. Он состоит в представленной ниже последовательности операций. Удалить из срезов парафин и регидратировать их обычным способом. Промыть срезы в дистиллированной воде в течение 5 мин. Поместить стекла со срезами в стеклянный сосуд (удобно использовать сосуды Хелендахела) с предварительно подогретым в термостате (58- 60 ºС) модифицированным цитратным буфером (pH 6,1; номер по каталогу S1700 - Dako, Дания) и подвергнуть процедуре теплового демаскирования антигенов в бытовой пароварке (TEFAL, Франция или в любой другой с вертикальным размером паровой камеры 8-10 см) в течение 20 мин (более подробно тепловое демаскирование описано ранее [4]). Охладить препараты в остывающем буфере в течение 15-20 мин. Остывшие предметные стекла со срезами промыть дистиллированной водой для удаления остатков демаскирующего раствора (1-2 мин) и поместить их в фосфатно-солевой буфер (ФСБ) на 5-10 мин. Аккуратно промокнуть стекло вокруг срезов фильтровальной бумагой (для образования сухого поля) и обвести область расположения срезов гидрофобным фломастером (например, DakoPen, Liquid Blocker, PAP Pen и др.). Сразу после этого, не допуская подсыхания срезов, нанести на них необходимое количество (около 100 мкл) блокировочного раствора - 5% раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA, номер по каталогу А2153, Sigma-Aldrich, США) на ФСБ или готового блокировочного раствора - Protein Block (Spring Bioscience, США) и оставить при комнатной температуре на 10 мин. 6. Удалить излишек блокировочного раствора без промывки. Нанести на срезы необходимое для их покрытия количество мышиных моноклональных антител к синаптофизину в разведении 1:30 и кроличьих поликлональных антител к ГДК (GAD67) в разведении 1:100, перемешав их на предметном стекле, аккуратно его покачивая. Общее количество смеси реагентов обычно не превышает 140 мкл. После этого поместить стекла во «влажные камеры» для предотвращения испарения реагентов и подсыхания срезов и поставить в термостат (27 ºС) на 60-66 ч. Смыть антитела промывочным буфером (ФСБ) и поместить стекла в стаканчик с аналогичным буфером на 5-7 мин. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов, нанести на срезы необходимое количество приготовленной заранее смеси вторичных антикроличьих и антимышиных антител (смешиваются в центрифужной пробирке равные объемы свиных антикроличьих антител, меченных TRITC, предварительно разведенных 1:10, и моновалентного Fab-фрагмента антимышиного иммуноглобулина осла, меченного биотином, предварительно разведенного 1:100). Препараты во влажных камерах поместить в термостат при 27 ºС на 180 мин. Смыть вторичные антитела промывочным буфером (ФСБ) и поместить стекла в стаканчик с ФСБ на 15-20 мин. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов, нанести на них раствор стрептавидина, конъюгированного с флюоресцентным красителем Cy2 в разведении 1:100 и поставить в термостат при 27 ºС на 30 мин. Смыть раствор конъюгата промывочным буфером (ФСБ) и промыть стекла в двух сменах дистиллированной воды по 5 мин в каждой. Промыть препараты абсолютированным изопропанолом в течение 30 с при постоянном перемешивании жидкости, поместить в смесь равных объемов орто-ксилола и изопропанола на 1 мин. Просветлить в двух порциях орто-ксилола (не более 1 мин) и заключить в перманентную быстровысыхающую нефлюоресцирующую среду (например, Cytoseal 60 - Thermo Scientific, США). Препарат готов для просмотра с использованием «сухих» объективов через 60 мин после заключения. При проведении флюоресцентной микроскопии с использованием фильтров, предназначенных для наблюдения флюоресценции флюорохромов FITC и TRITC, синаптофизин-и ГДК-иммунопозитивные структуры проявляют зеленую и красную флюоресценцию соответственно. Двойная иммуногистохимическая реакция на ГДК и синаптофизин при проведении конфокальной лазерной микроскопии препаратов мозжечка позволяет определить ГДК-содержащие (флюоресцирующие в красном диапазоне видимого спектра) и синаптофизин-позитивные (флюоресцирующие в зеленом диапазоне видимого спектра) структуры (рисунок, а). В молекулярном слое преобладают гранулы зеленого цвета, их расположение имеет отчетливый градиент в соответствии с поперечным по отношению к коре мозжечка направлением крупных дендритов клеток Пуркинье. Красные ГДКсодержащие вкрапления выглядят как округлые мелкие образования: бóльшие по размеру вкрапления расположены в глубоких частях молекулярного слоя. Ядра клеток Пуркинье не окрашиваются, их цитоплазма и отростки ГДК-позитивны. На фоне клеток Пуркинье отчетливой интенсивно красной окраской выделяются корзинки нервных волокон. В них синаптофизин-позитивные структуры выявляются неотчетливо. В зернистом слое мозжечка определяются зеленые синаптофизин-позитивные части клубочков мозжечка - терминали моховидных волокон, розетки которых содержат синаптические пузырьки (см. рисунок, б). Красные ГДКиммунопозитивные структуры (ГАМК-ергические аксоны звездчатых нейронов - клеток Гольджи) часто расположены на периферии клубочков (см. рисунок, б). В периферической части клубочков наблюдается совместная локализация ГДК-и синаптофизин-иммунопозитивных структур, что свидетельствует о присутствии в этой зоне ГАМКергических синапсов (см. рисунок, г). Таким образом, представленный протокол обработки препаратов позволяет выявлять ГАМКергические синапсы среди других синапсов мозжечка и проводить как раздельный, так и одновременный анализ синаптофизин-и ГДК-иммунопозитивных структур мозжечка в парафиновых срезах.
×

About the authors

D. E. Korzhevskiy

RAS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine; St. Petersburg State University

Email: iemmorphol@yandex.ru

Ye. G. Gilerovich

RAS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

O. V. Kirik

RAS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

O. S. Alekseyeva

RAS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine; RAS I. M. Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry

I. P. Grigoriyev

RAS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

References

  1. Гилерович Е. Г. Иммуногистохимическое изучение структурных основ торможения в центральных ядрах мозжечка у мышей // Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 1998. Т. 84, № 12. С. 1325-1332.
  2. Гилерович Е. Г., Мошонкина Т. Р., Федорова Е. А. и др. Морфофункциональная характеристика поясничного утолщения спинного мозга крысы // Морфология. 2007. Т. 132, вып. 5. С. 33-37.
  3. Гиляров А. В., Кирик О. В., Коржевский Д. Э. Сравнительный анализ методических подходов, применяемых для одновременного выявления нескольких антигенов при иммуногистохимическом исследовании // Морфология. 2010. Т. 138, вып. 5. С. 59-64.
  4. Коржевский Д. Э., Кирик О. В., Карпенко М. Н. и др. Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии. СПб.: СпецЛит, 2014.
  5. Коржевский Д. Э., Сухорукова Е. Г., Гилерович Е. Г. и др. Преимущества и недостатки цинк-этанол-формальдегида как фиксатора для иммуноцитохимических исследований и конфокальной лазерной микроскопии // Морфология. 2013. Т. 143, вып. 2. С. 81-85.
  6. Сухарева Б. С., Дарий Е. Л., Христофоров Р. Р. Глутаматдекарбоксилаза: структура и каталитические свойства // Успехи биол. химии. 2001. Т. 41. С. 131-162.
  7. Evans G. J., Cousin M. A. Tyrosine phosphorylation of synaptophysin in synaptic vesicle recycling // Biochem. Soc. Trans. 2005. Vol. 33 (Pt. 6). P. 1350-1353.
  8. Garin N., Escher G. The development of inhibitory synaptic specializations in mouse deep cerebellar nuclei // Neuroscience. 2001. Vol. 105. P. 431-441.
  9. Manto M., De Zeeuw C. I. Diversity and complexity of roles of granule cells in the cerebellar cortex // Cerebellum. 2012. Vol. 11. P. 1-4.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2015 Eco-Vector


Периодический печатный журнал зарегистрирован как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): № 0110212 от 08.02.1993.
Сетевое издание зарегистрировано как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): ЭЛ № ФС 77 - 84733 от 10.02.2023.