ОДНОВРЕМЕННОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ ГЛУТАМАТДЕКАРБОКСИЛАЗЫ И СИНАПТОФИЗИНА В ПАРАФИНОВЫХ СРЕЗАХ МОЗЖЕЧКА КРЫСЫ



Цитировать

Полный текст

Аннотация

В работе представлен хорошо воспроизводимый и экономичный протокол одновременного выявления глутаматдекарбоксилазы (ГДК) - ключевого фермента синтеза γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) и синаптофизина - маркерного белка синаптических пузырьков с помощью конфокальной лазерной микроскопии. ГДК в коре мозжечка крысы маркирует клетки Пуркинье и корзинки нервных волокон в их базальной части и неравномерно распределена в нейропиле молекулярного и зернистого слоёв. Синаптофизин в молекулярном слое четко контурирует крупные дендриты клеток Пуркинье, в зернистом - маркирует части клубочков мозжечка - терминали моховидных волокон. ГДК-иммунопозитивные структуры (ГАМКергические аксоны звездчатых нейронов - клеток Гольджи) часто расположены на периферии клубочков. В периферической части клубочков наблюдается солокализация ГДК-и синаптофизин-иммунопозитивных структур, что свидетельствует о присутствии в этой зоне ГАМК-ергических синапсов.

Полный текст

Современные методы иммуноцитохимии позволяют проводить селективное маркирование синаптических белков и видеть крупные синапсы на уровне световой микроскопии [2]. Однако медиаторная принадлежность выявляемых синапсов требует уточнения. Для этого могут быть использованы методы двойного иммуноцитохимического маркирования [3]. В этом случае наиболее информативными являются исследования, проводимые с применением конфокальной лазерной микроскопии, поскольку они дают возможность независимого выявления двух различных флюорохромов и более, локализованных в одной микроструктуре изучаемого препарата. Применение двойного иммуноцитохимического маркирования и конфокальной микроскопии является необходимым условием для адекватного анализа солокализации синаптических и медиаторных маркеров. Такой подход позволяет судить не только о структурной организации синаптического аппарата, но и о медиаторной принадлежности выявляемых нервных окончаний. Несмотря на то, что рядом авторов [1, 8] опубликованы работы, свидетельствующие о возможности выявления глутаматдекарбоксилазы (ГДК) - ключевого фермента синтеза γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) [6] - на уровне различных звеньев рефлекторных дуг мозжечка у лабораторных животных, до сих пор отсутствует универсальный подход, позволяющий анализировать синаптический аппарат в архивном материале, хранящемся длительное время в парафиновых блоках. Этот методический пробел существенно уменьшает возможности исследователя анализировать ранее полученный экспериментальный материал и проводить ретроспективные нейробиологические исследования мозжечка сравнительного характера. Цель настоящего исследования состояла в разработке хорошо воспроизводимого протокола, позволяющего с минимально возможными трудозатратами и экономически оправданным использованием дорогостоящих реагентов эффективно определять совместную локализацию ГДК и синаптофизина - маркерного белка синаптических пузырьков [7], а также выявлять у крысы клубочки мозжечка - органоспецифические синаптические комплексы [9]. В работе использованы парафиновые блоки коры мозжечка половозрелых крыс-самцов линии Вистар (n=5) из архива лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы Института экспериментальной медицины. Материал был фиксирован в цинкэтанол-формальдегиде [5], обезвожен и залит в парафин по общепринятой методике. Из архивных блоков готовили срезы толщиной 5 и 10 мкм и наклеивали их на предметные стекла с адгезивным покрытием - «Polysine» (Menzel, Германия). Для выявления синаптофизина применяли мышиные моноклональные антитела к синаптофизину (клон SY38, Dako, Дания). ГДК выявляли с использованием кроличьих поликлональных антител к изоформе фермента GAD67 (Spring Bioscience, США). В качестве вторичных реагентов применяли биотинилированный антимышиный Fab-фрагмент иммуноглобулинов осла (Jackson ImmunoResearch, США), стрептавидин, конъюгированный с флюоресцентным красителем Cy2 (Jackson ImmunoResearch, США), и антикроличьи иммуноглобулины свиньи, связанные с тетраметилродаминизотиоцианатом (TRITC, Dako, Дания). В результате применения различных режимов инкубации срезов и подбора вариантов разведения реагентов был разработан оптимальный (по соотношению трудозатрат, объемов использованных реагентов и качеству получаемых препаратов) протокол. Он состоит в представленной ниже последовательности операций. Удалить из срезов парафин и регидратировать их обычным способом. Промыть срезы в дистиллированной воде в течение 5 мин. Поместить стекла со срезами в стеклянный сосуд (удобно использовать сосуды Хелендахела) с предварительно подогретым в термостате (58- 60 ºС) модифицированным цитратным буфером (pH 6,1; номер по каталогу S1700 - Dako, Дания) и подвергнуть процедуре теплового демаскирования антигенов в бытовой пароварке (TEFAL, Франция или в любой другой с вертикальным размером паровой камеры 8-10 см) в течение 20 мин (более подробно тепловое демаскирование описано ранее [4]). Охладить препараты в остывающем буфере в течение 15-20 мин. Остывшие предметные стекла со срезами промыть дистиллированной водой для удаления остатков демаскирующего раствора (1-2 мин) и поместить их в фосфатно-солевой буфер (ФСБ) на 5-10 мин. Аккуратно промокнуть стекло вокруг срезов фильтровальной бумагой (для образования сухого поля) и обвести область расположения срезов гидрофобным фломастером (например, DakoPen, Liquid Blocker, PAP Pen и др.). Сразу после этого, не допуская подсыхания срезов, нанести на них необходимое количество (около 100 мкл) блокировочного раствора - 5% раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA, номер по каталогу А2153, Sigma-Aldrich, США) на ФСБ или готового блокировочного раствора - Protein Block (Spring Bioscience, США) и оставить при комнатной температуре на 10 мин. 6. Удалить излишек блокировочного раствора без промывки. Нанести на срезы необходимое для их покрытия количество мышиных моноклональных антител к синаптофизину в разведении 1:30 и кроличьих поликлональных антител к ГДК (GAD67) в разведении 1:100, перемешав их на предметном стекле, аккуратно его покачивая. Общее количество смеси реагентов обычно не превышает 140 мкл. После этого поместить стекла во «влажные камеры» для предотвращения испарения реагентов и подсыхания срезов и поставить в термостат (27 ºС) на 60-66 ч. Смыть антитела промывочным буфером (ФСБ) и поместить стекла в стаканчик с аналогичным буфером на 5-7 мин. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов, нанести на срезы необходимое количество приготовленной заранее смеси вторичных антикроличьих и антимышиных антител (смешиваются в центрифужной пробирке равные объемы свиных антикроличьих антител, меченных TRITC, предварительно разведенных 1:10, и моновалентного Fab-фрагмента антимышиного иммуноглобулина осла, меченного биотином, предварительно разведенного 1:100). Препараты во влажных камерах поместить в термостат при 27 ºС на 180 мин. Смыть вторичные антитела промывочным буфером (ФСБ) и поместить стекла в стаканчик с ФСБ на 15-20 мин. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов, нанести на них раствор стрептавидина, конъюгированного с флюоресцентным красителем Cy2 в разведении 1:100 и поставить в термостат при 27 ºС на 30 мин. Смыть раствор конъюгата промывочным буфером (ФСБ) и промыть стекла в двух сменах дистиллированной воды по 5 мин в каждой. Промыть препараты абсолютированным изопропанолом в течение 30 с при постоянном перемешивании жидкости, поместить в смесь равных объемов орто-ксилола и изопропанола на 1 мин. Просветлить в двух порциях орто-ксилола (не более 1 мин) и заключить в перманентную быстровысыхающую нефлюоресцирующую среду (например, Cytoseal 60 - Thermo Scientific, США). Препарат готов для просмотра с использованием «сухих» объективов через 60 мин после заключения. При проведении флюоресцентной микроскопии с использованием фильтров, предназначенных для наблюдения флюоресценции флюорохромов FITC и TRITC, синаптофизин-и ГДК-иммунопозитивные структуры проявляют зеленую и красную флюоресценцию соответственно. Двойная иммуногистохимическая реакция на ГДК и синаптофизин при проведении конфокальной лазерной микроскопии препаратов мозжечка позволяет определить ГДК-содержащие (флюоресцирующие в красном диапазоне видимого спектра) и синаптофизин-позитивные (флюоресцирующие в зеленом диапазоне видимого спектра) структуры (рисунок, а). В молекулярном слое преобладают гранулы зеленого цвета, их расположение имеет отчетливый градиент в соответствии с поперечным по отношению к коре мозжечка направлением крупных дендритов клеток Пуркинье. Красные ГДКсодержащие вкрапления выглядят как округлые мелкие образования: бóльшие по размеру вкрапления расположены в глубоких частях молекулярного слоя. Ядра клеток Пуркинье не окрашиваются, их цитоплазма и отростки ГДК-позитивны. На фоне клеток Пуркинье отчетливой интенсивно красной окраской выделяются корзинки нервных волокон. В них синаптофизин-позитивные структуры выявляются неотчетливо. В зернистом слое мозжечка определяются зеленые синаптофизин-позитивные части клубочков мозжечка - терминали моховидных волокон, розетки которых содержат синаптические пузырьки (см. рисунок, б). Красные ГДКиммунопозитивные структуры (ГАМК-ергические аксоны звездчатых нейронов - клеток Гольджи) часто расположены на периферии клубочков (см. рисунок, б). В периферической части клубочков наблюдается совместная локализация ГДК-и синаптофизин-иммунопозитивных структур, что свидетельствует о присутствии в этой зоне ГАМКергических синапсов (см. рисунок, г). Таким образом, представленный протокол обработки препаратов позволяет выявлять ГАМКергические синапсы среди других синапсов мозжечка и проводить как раздельный, так и одновременный анализ синаптофизин-и ГДК-иммунопозитивных структур мозжечка в парафиновых срезах.
×

Об авторах

Дмитрий Эдуардович Коржевский

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН

Email: iemmorphol@yandex.ru
лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12

Елена Георгиевна Гилерович

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12

Ольга Викторовна Кирик

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12

Ольга Сергеевна Алексеева

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12

Игорь Павлович Григорьев

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12

Список литературы

  1. Гилерович Е. Г. Иммуногистохимическое изучение структурных основ торможения в центральных ядрах мозжечка у мышей // Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 1998. Т. 84, № 12. С. 1325-1332.
  2. Гилерович Е. Г., Мошонкина Т. Р., Федорова Е. А. и др. Морфофункциональная характеристика поясничного утолщения спинного мозга крысы // Морфология. 2007. Т. 132, вып. 5. С. 33-37.
  3. Гиляров А. В., Кирик О. В., Коржевский Д. Э. Сравнительный анализ методических подходов, применяемых для одновременного выявления нескольких антигенов при иммуногистохимическом исследовании // Морфология. 2010. Т. 138, вып. 5. С. 59-64.
  4. Коржевский Д. Э., Кирик О. В., Карпенко М. Н. и др. Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии. СПб.: СпецЛит, 2014.
  5. Коржевский Д. Э., Сухорукова Е. Г., Гилерович Е. Г. и др. Преимущества и недостатки цинк-этанол-формальдегида как фиксатора для иммуноцитохимических исследований и конфокальной лазерной микроскопии // Морфология. 2013. Т. 143, вып. 2. С. 81-85.
  6. Сухарева Б. С., Дарий Е. Л., Христофоров Р. Р. Глутаматдекарбоксилаза: структура и каталитические свойства // Успехи биол. химии. 2001. Т. 41. С. 131-162.
  7. Evans G. J., Cousin M. A. Tyrosine phosphorylation of synaptophysin in synaptic vesicle recycling // Biochem. Soc. Trans. 2005. Vol. 33 (Pt. 6). P. 1350-1353.
  8. Garin N., Escher G. The development of inhibitory synaptic specializations in mouse deep cerebellar nuclei // Neuroscience. 2001. Vol. 105. P. 431-441.
  9. Manto M., De Zeeuw C. I. Diversity and complexity of roles of granule cells in the cerebellar cortex // Cerebellum. 2012. Vol. 11. P. 1-4.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Эко-Вектор, 2015


Периодический печатный журнал зарегистрирован как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): № 0110212 от 08.02.1993.
Сетевое издание зарегистрировано как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): ЭЛ № ФС 77 - 84733 от 10.02.2023.