A SYNAPTIC MARKER SYNAPTOPHYSIN

Full Text

В морфологическом исследовании нервной системы большое значение имеет выявление синаптических окончаний. В связи с малыми размерами синаптических терминалей (как правило, менее 1 мкм) до последнего времени изучать их можно было только в электронном микроскопе. Электронная микроскопия позволяет рассмотреть ультраструктурные особенности синапсов и их взаимоотношения с окружающими элементами нервной ткани [2, 7, 10], однако не даёт возможности оценить качественные и количественные характеристики распределения синаптических окончаний в том или ином отделе нервной системы в целом. Для изучения распределения синапсов в пределах крупных анатомических структур мозга можно было бы использовать световой микроскоп, но только при условии их селективной окраски. Хотя световая микроскопия и не позволяет в деталях рассмотреть синаптические окончания, современный уровень иммуноцитохимии даёт возможность маркировать определённые белки, специфически связанные с аксональными терминалями, и, тем самым, наглядно показать области их распределения с помощью светового и конфокального лазерного микроскопов. Известно несколько белков, связанных с синаптическими структурами. Первым из них был выделен и охарактеризован синаптофизин (СФ) [33, 43, 59]. Цель настоящего обзора - обобщение современных данных о синаптическом маркере (СФ), его функциональной роли в клетке и использовании иммуноцитохимической реакции на этот белок для маркирования синаптических контактов. СФ (также известный как p38) - это трансмембранный гликопротеин мелких пресинаптических пузырьков нервных клеток и некоторых микровезикул в нейроэндокринных клетках [24]. Его молекулярная масса - 38 000 дальтон [58]. Он входит в группу MARVEL (MAL and Related proteins for VEsicle trafficking and membrane Link) - семейства интегральных белков, связанных с мембраной [20]. В настоящее время СФ относят к семейству белков с четырьмя трансмембранными доменами, которое, помимо СФ, включает синаптогирин и синаптопорин. СФ является наиболее распространенным белком синаптических пузырьков, составляя около 10% от общего количества их белка [36]. С помощью ультраструктурной иммуноцитохимии СФ выявлен во всех малых (не содержащих пептиды) синаптических пузырьках в нервной системе, независимо от того, какой нейромедиатор они содержат, но не был обнаружен в мембранах крупных гранулярных пептид-содержащих пузырьков [25, 43, 56]. За пределами ЦНС СФ выявлен не только в аксонах нейронов, но и в дендритах [28, 49]. Однако локализация СФ в постсинаптических структурах не повсеместна. Отмечено присутствие СФ в чашевидных окончаниях клеток вестибулярного эпителия, которые являются постсинаптическими элементами [27, 48]. Также имеются данные о присутствии СФ в сенсорных окончаниях нейромышечного веретена и сухожилий [26]. Эти данные свидетельствуют о возможности выделения нейромедиаторов афферентными и постсинаптическими структурами, но они требуют детальной проверки. Предполагаемые функции СФ в клетке Основные функции СФ связывают с формированием синаптических пузырьков, выделением из них нейромедиаторов и синаптогенезом. Известно, что мембрана синаптических пузырьков обогащена холестерином в сравнении с другими мембранами нейронов. Было показано, что одним из основных холестерин-связывающих белков пузырьков является СФ. На этом факте основывается мнение, что он является одним из ключевых белков, необходимых для биогенеза синаптических пузырьков [55]. Экзоцитоз содержимого синаптических пузырьков происходит при участии комплекса мембранных белков, которые обычно называют SNARE (Soluble N-ethylmaleimidesensitive factor Attachment protein REceptor). Этот комплекс включает синаптобревин, который локализован в мембранах синаптических пузырьков, синтаксин-1 и белок SNAP25 (SyNaptosomal-Associated Protein, 25 kD), которые локализованы, преимущественно, в синаптической мембране [21]. В процессе формирования комплекса SNARE важную роль играет взаимодействие СФ и синаптобревина. Поэтому считается, что СФ выступает в роли внутреннего регулятора формирования комплекса SNARE [21] и, соответственно, регулятора экзоцитоза нейромедиатора из синаптических пузырьков. Взаимодействие пузырька с плазмолеммой происходит через формирование пор слияния. В этом процессе СФ также принимает непосредственное участие [25, 29]. Известны два механизма слияния пузырьков: полное и переходное (также известное как kiss-and-run). Ряд исследователей доказывают, что взаимодействие СФ с синаптобревином может регулировать выбор между kiss-and-run и полным слиянием [20]. Когда синаптический пузырек закреплен на мембране, олигомеры СФ могут быть встроены в мембрану в месте слияния в комплексе с еще неизвестными компонентами плазмолеммы, что вызывает формирование каналов для быстрого освобождения нейромедиаторов во время kiss-and-run или полного слияния. В быстрых синапсах экзоцитоз регулируется ионами кальция. Известно, что цитоплазматический фрагмент СФ содержит кальций-связывающий сайт и, следовательно, может участвовать в кальций-зависимом пусковом механизме, который инициирует слияние мембраны пузырька с пресинаптической мембраной и выделение нейромедиатора в синаптическую щель [54]. Существуют косвенные данные, подтверждающие предположение о важной роли СФ в синаптогенезе. Установлено, что СФ появляется в аксональных конусах роста до формирования синапсов [38]. В ходе изучения процесса образования межклеточных контактов в культуре нервной ткани гиппокампа, содержащей клетки, лишенные СФ, было выявлено значительное снижение плотности расположения синапсов у мутантных клеток по сравнению с СФ-содержащими [53]. Несмотря на представленные доказательства важной роли СФ в нервной клетке, окончательное решение вопроса о его месте в регуляторных механизмах, связанных с выделением нейромедиаторов в нервной системе у млекопитающих, пока не найдено. Ответ на вопрос о функциях СФ существенно затруднен в связи с получением результатов исследований, выполненных на мышах, лишенных гена СФ (нокаутных животных) [40]. Оказалось, что присутствие СФ не является обязательным для функционирования синапсов. Позднее было установлено, что у таких мышей все же имеются некоторые несущественные признаки нарушения синаптических структур [52]. СФ как маркер синаптических структур Несмотря на отсутствие определенности в решении вопроса о функциональной роли СФ в нервной клетке, иммуноцитохимическую реакцию на СФ широко используют в нейробиологических исследованиях для маркирования синаптических структур. Иммуногистохимическое выявление СФ применяется в исследованиях, касающихся как центральной, так и периферической нервной системы. В ЦНС, в структурах, где количество синапсов велико, а размеры их малы (менее 0,5 мкм) при использовании световой микроскопии трудно различить отдельные синапсы, но можно проводить оценку плотности их расположения. При помощи сложной математической обработки и оптического сегментирования полученных изображений возможно осуществлять ранжирование выявляемых СФ-иммунопозитивных частиц [9]. Такой подход способствует объективизации представляемых данных и позволяет проводить сравнительный количественный анализ. Наиболее эффективно реакцию на СФ можно использовать при изучении крупных синапсов (0,5-2 мкм и более). Такие синапсы присутствуют не во всех структурах головного мозга [46]. Среди них особого внимания заслуживают сложные синаптические комплексы зернистого слоя мозжечка - клубочки, которые сформированы при участии терминалей моховидных (афферентных) волокон [62]. В настоящее время разработан методический подход, позволяющий успешно выявлять клубочки мозжечка у человека с помощью реакции на СФ и конфокальной лазерной микроскопии [1]. Для характеристики синаптического аппарата различных цитоархитектонических зон гиппокампа при проведении иммуноцитохимического исследования с использованием реакции на СФ может быть использовано 2 принципиально различных подхода - денситометрический и стереологический анализ [23]. В первом случае проведение исследования требует меньше трудозатрат, однако во втором случае результаты более информативны. Авторами исследования были получены интересные данные, касающиеся глубины проникновения антител при обработке срезов большой толщины (25 мкм). Оказалось, что эффективная реакция на СФ наблюдается на глубине до 13 мкм [23]. К сожалению, в данной статье нет сведений о сроках инкубации срезов с различными реактивами. Поэтому невозможно определить, обусловлено неполное окрашивание срезов свойствами маркера и особенностью ткани или вызвано недостаточной продолжительностью обработки в растворах иммуноцитохимических реагентов. Наряду с другими маркерами, СФ успешно используется для изучения иннервации различных внутренних органов в норме и при патологии [14-18, 22, 51, 57]. В результате работ, посвященных изучению тимуса, было установлено, что в постнатальном периоде развития его тучные клетки солокализуются с СФ-иммунопозитивными нервными терминалями [3]. С использованием этого маркера выявляли синаптические структуры в различных отделах сердца [17]. При этом, структура и характер распределения СФ-иммунопозитивных терминалей в оболочках сердца дают основание считать выявляемые структуры эфферентными. В пользу этого свидетельствует и сравнение результатов выявления СФ с результатами реакции на другой нейральный маркер - PGP 9,5 [19], при помощи которого можно определить и афферентные терминали. В этом контексте несколько странным кажется мнение F.С.Shenton и S. Pyner о преимущественном накоплении СФ в афферентных нервных волокнах [51]. Столь различный взгляд специалистов на возможность присутствия СФ в афферентных и эфферентных нервных волокнах в периферической нервной системе свидетельствует об актуальности фундаментальных исследований синаптических белков и необходимости использования комплекса маркеров при анализе иннервации внутренних органов. Очевидно, что экспрессия СФ во внутренних органах тесно связана с распределением в них нервных волокон и количеством синапсов. В связи с этим реакция на СФ часто применяется в онтогенетических исследованиях. Так, S. He и J. Yang [31] изучали развитие слухового аппарата у крысы с применением антител к СФ и синаптобревину. С использованием специфических иммуногистохимических маркеров, включая СФ, описаны особенности развития сетчатки глаза у свиньи в эмбриогенезе [30]. Также в ряде исследований метод иммуноцитохимии применяется для оценки экспрессии белка синаптических пузырьков в развивающейся сетчатке глаза у человека, в головном мозгу у развивающихся крыс после пренатальной гипоксии и в условиях снижения количества серотонина [11, 13, 32, 42]. СФ, как маркер, широко используется в изучении нейромышечных синапсов [61]. Отдельно следует остановиться на использовании СФ при изучении дифференцировки нейрогенных клеток в культуре и in vivo. СФ, несомненно, является одним из наиболее надежных маркеров нейральной и нейроэндокринной дифференцировки [4]. Поэтому его широко используют при типировании нейроэндокринных опухолей [34, 35] и изучении развития органов нервной системы [47]. При изучении формирования связей центральной и периферической нервной системы в эмбриогенезе также широко применяется иммуногистохимическое выявление СФ. Установление связей между нейронами спинного мозга и чувствительных узлов спинномозговых нервов важно для завершения дифференцировки как тех, так и других. Обнаружено, что формирование синапсов между нервными волокнами чувствительных клеток узлов спинномозговых нервов и нейронами спинного мозга у крысы начинается на 19-е сутки пренатального развития [5]. СФ в нейроэндокринных и других клетках В настоящее время показано, что экспрессия СФ не ограничивается нейронами. Он был обнаружен в микровезикулах нейроэндокринных клеток нейрального и эпителиального типов. Описана экспрессия СФ в хромаффинных клетках мозгового вещества надпочечников, в то время как в стероид-продуцирующих клетках коры надпочечников белок не определялся. Иммунопозитивными являются эндокринные клетки аденогипофиза, бронхов, пищеварительного тракта, клетки островков поджелудочной железы, С-клетки щитовидной железы, клетки околощитовидной железы [16, 37, 41, 43, 45]. СФ-иммунореактивность была определена в нейроэпителиальных тельцах легкого [12], которые рассматриваются, преимущественно, как сенсорные структуры. СФ присутствует и в клетках различных нейроэндокринных опухолей [35]. В нейроэндокринных клетках секреторные продукты хранятся в гранулах, которые можно рассматривать как эквивалент крупных (до 200 нм) пузырьков с электронно-плотным ядром, имеющихся в нейронах. Помимо них, нейроэндокринные клетки содержат отличающиеся от типичных секреторных гранул микровезикулы (менее 90 нм в диаметре), которые схожи с синаптическими пузырьками нейронов как по размерам, так и способу участия в экзо-и эндоцитозе. Из-за этих особенностей они были названы микровезикулами синаптического типа [56]. Именно они содержат СФ в эндокринных клетках, хотя некоторые исследователи сообщают о присутствии СФ и в мембранах хромаффинных гранул [39, 44, 50, 60]. Среди работ, посвященных выявлению СФ в нейроэндокринных клетках, выделяется исследование А. В. Московского, который обнаружил в пульпе зуба у человека клетки, дающие положительную реакцию цитоплазмы на СФ. Кроме СФ-иммунопозитивных клеток, в пульпе зуба присутствовали и клетки, проявляющие реакцию на хромогранин А - общеизвестный маркер нейроэндокринных клеток. К сожалению, в этом исследовании не проводилась идентификация возможных секреторных продуктов этих клеток [8]. Из других клеток (не являющихся ни нервными, ни эндокринными), экспрессирующих СФ, известно только о перисинусоидных, жиронакапливающих клетках (клетки Ито), печени, называемых D. Cassiman и соавт. звездчатыми клетками [24]. Данные исследователи не только установили, что СФ присутствует в этих клетках, но и рекомендовали его как новый маркер. В здоровой и поврежденной печени авторы изучили распределение СФ в интактных, а также в активированных перисинусоидных клетках у человека и крысы. Авторы продемонстрировали наличие множества электронно-прозрачных пузырьков в цитоплазме этих клеток у человека, сравнимых (по их мнению) с синаптическими пузырьками нейронов. Следует заметить, что выводы авторов нуждаются в скрупулезной проверке, поскольку для выявления СФ ими был использован всего один вариант поликлональных антител, а электронные микрофотографии даны без масштабных отрезков, что затрудняет оценку размеров обнаруженных пузырьков. Кроме того, полученные результаты не были подтверждены с использованием ультраструктурного иммуноцитохимического исследования. Заключение Приведенные литературные данные и собственный опыт авторов обзора дают основания для заключения, что на сегодняшний день СФ является важнейшим маркером синапсов, позволяющим при помощи световой и конфокальной лазерной микроскопии получать достоверные данные о структурной организации крупных синаптических структур ЦНС. Он незаменим и при исследовании эфферентной иннервации внутренних органов. Использование количественного анализа СФ-иммунопозитивных структур позволяет решать ряд задач, которые ранее можно было решить только с использованием электронной микроскопии. Особого внимания заслуживает неожиданная устойчивость СФ при использовании обычных и специальных методов фиксации [6, 47]. Ассоциация СФ с синаптическими и подобными им пузырьками нейроэндокринных клеток определяет его высокую специфичность как иммуноцитохимического маркера. Несмотря на недостаточную ясность значения СФ для формирования синаптических пузырьков и экзоцитоза нейромедиаторов, функциональная трактовка усиления и ослабления реакции на СФ не вызывает сомнения и определяется увеличением и, соответственно, уменьшением числа синаптических пузырьков и функционирующих синапсов. В отношении применения реакции на СФ при исследовании иннервации внутренних органов сохраняется неопределенность для трактовки функциональности выявляемых терминалей. Вероятно, дальнейшие исследования с использованием комплекса маркеров афферентных и эфферентных нервных волокон позволят пролить свет на загадочные несоответствия в этом вопросе.

About the authors

Ye. A. Kolos

RAS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

I. P. Grigoriyev

RAS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

D. E. Korzhevskiy

RAS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

Email: iemmorphol@yandex.ru

References

Supplementary files