EXTRUSION OF THE TRACHEAL EPITHELIAL CELLS (IN VIVO STUDY)

Full Text

В обеспечении структурной и функциональной целостности эпителиального пласта, наряду с пролиферацией и дифференцировкой клеток, существенную роль играют процессы элиминации эпителиоцитов; сбалансированность этих процессов обеспечивается сложным комплексом внутритканевых регуляторных механизмов [5, 6]. В последние годы показано, что физиологическая убыль эпителиоцитов реализуется не только через механизмы апоптоза [10], из пласта элиминируются и морфологически жизнеспособные (без инициации гибели) элементы [5, 9]. Последний механизм запускается по достижении критического уровня клеточной плотности эпителиального пласта путем включения сфингозин1-фосфат- и Rho-киназо-зависимого сокращения акто-миозинового комплекса в базальных частях пласта вокруг элиминируемой клетки и ослабления ее межклеточных контактов с окружающими элементами [7, 8]. Применительно к многорядному реснитчатому эпителию воздухоносных путей показана важная роль апоптоза, как механизма элиминации поврежденных клеток в норме и при развитии патологических процессов (гиперплазия, воспаление) [11]; сведения о возможности элиминации из пласта жизнеспособных эпителиоцитов отсутствуют. Целью настоящего исследования явились проведение прижизненного анализа феномена экструзии клеток эпителия трахеи, выделение фаз процесса и последующая регистрации их морфологических эквивалентов на гистологических срезах. Материал и методы. Изучена трахея 35 белых крыс-самцов линии Вистар в возрасте 3, 6, 12, 18 и 24 мес (по 6-8 животных в возрастной группе). Прижизненную видеофиксацию состояния многорядного реснитчатого эпителия осуществляли при помощи программно-аппаратного комплекса НПО «Азимут» (Россия) согласно детально описанной ранее методике [1]. Выбирали поле зрения, в котором хорошо видна эпителиальная выстилка, изображение воспроизводили на мониторе компьютера в режиме реального времени, записывали на жесткий диск и анализировали на видеофайлах. Гистологическое исследование слизистой оболочки проводили по стандартной методике: после фиксации в смеси Буэна и заливки в парафин гистологические срезы толщиной 3-5 мкм окрашивали гематоксилином - эозином. Частоту встречаемости эпителиоцитов на разных стадиях экструзии определяли на основании подсчета 1-2 тыс. клеток в эпителиальном пласте у каждого животного. Цифровой материал обрабатывали методами вариационной статистики. Результаты исследования. В ходе анализа видеофайлов при изучении двигательной активности цилиарного аппарата эпителия трахеи феномен экструзии эпителиоцитов из пласта был зарегистрирован редко. Основные этапы процесса, наблюдаемые на эпителиальной поверхности, показаны на рис. 1 (кинограмма). Морфологическая идентификация начала процесса возможна после появления апикальной части элиминируемой клетки над поверхностью эпителия (см. рис. 1, б), после чего следуют выход ее ядросодержащей части (см. рис. 1, в, г) и окончательное выделение клетки из пласта. О жизнеспособности элиминируемого эпителиоцита свидетельствует морфологически неизмененная структура его ядра, сравнимая с таковой в оставшихся клетках пласта. Экструдированная клетка вначале фиксирована на поверхности эпителия (см. рис. 1, е), а затем отрывается и элиминируется движением слизи. Процесс собственно экструзии - довольно быстрый: от появления апикальной части элиминируемой клетки над эпителиальным пластом до фиксации клетки на его поверхности (см. рис. 1, б-е) проходят 1,5-2 с, в то время как продолжительность нахождения экструдированной клетки на поверхности пласта до момента отрыва колеблется от 8-8,5 с до нескольких минут (максимальное время наблюдения этой фазы составило 10 мин). При анализе 31 видеофайла, на которых удалось зарегистрировать клеточную экструзию эпителиоцитов на разных этапах процесса, обнаружено, что в 7 (22,6%) случаях элиминировались элементы без ресничек на апикальной поверхности (предположительно вставочные клетки, см. рис. 1), в 24 (77,4%) наблюдениях из пласта выделялись дифференцированные реснитчатые эпителиоциты (рис. 2). У подавляющего большинства последних (20) двигательная активность ресничек отсутствовала, однако в 4 случаях клетки, фиксированные на поверхности, обладали отчетливо выраженной активностью цилиарного аппарата (частота колебаний их ресничек составила 32,5% от соответствующего показателя у клеток в составе пласта). Анализ гистологических препаратов трахеи (рис. 3) позволил идентифицировать морфологические эквиваленты фаз процесса экструзии, зарегистрированных при прижизненной видеосъемке. Фазы выхода клетки из пласта (см. рис. 3, а-в) встречались относительно редко, в 90% наблюдений превалировали более поздние фазы процесса (см. рис. 3, г-е). Такое соотношение фаз объясняется существенно большей продолжительностью последних в режиме реального времени. При этом, наряду с клетками с морфологически неизмененным ядром (см. рис. 3, а, в, д), из эпителиального пласта элиминируются клетки с фрагментированными (см. рис. 3, б) и пикнотичными (см. рис. 3, г, е) ядрами. На гистологических препаратах эпителия трахеи обнаружено, что частота встречаемости клеток, находящихся в процессе экструзии, у взрослых и старых крыс (12-24 мес) в 1,9-2 раза выше, чем у молодых (3-6 мес) крыс (таблица). Подавляющее большинство элиминируемых клеток (90 из 115, 78%) имели ядра в состоянии кариопикноза и кариорексиса, однако 22% эпителиоцитов содержали морфологически неизмененные ядра. Обсуждение полученных данных. В результате прижизненных наблюдений впервые продемонстрирована динамика процесса экструзии эпителиоцитов из пласта in vivo, на основании чего определены критерии регистрации элиминируемых клеток на гистологических срезах. Показано, что в многорядном реснитчатом эпителии, как и в других разновидностях эпителиальных тканей (однослойный эпителий толстой кишки человека, рецепторный эпителий внутреннего уха у птиц, культура клеток эпителия почки собаки, эпидермальный эпителий зародышей рыб), экструзии подвергаются не только гибнущие клетки, но и морфологически жизнеспособные элементы [4, 6]; согласно данным прижизненных наблюдений и анализа гистологических срезов, доля жизнеспособных клеток (сохраненная двигательная активность ресничек, морфологически неизмененная структура ядра) не превышает 25% от общего числа элиминируемых эпителиоцитов. Суммарная доля клеток на разных стадиях экструзии, рассчитанная на гистологических препаратах трахеи у взрослых и старых животных (0,9-1,2‰), сопоставима с уровнем митотической активности эпителиоцитов в пласте (0,4-1,1‰ - [3]). Оценка частоты встречаемости эпителиоцитов, находящихся в процессе экструзии из морфологически и функционально дифференцированного эпителия трахеи, показала, что у взрослых и старых крыс такие клетки обнаруживаются чаще, чем у молодых [2]. Использование разработанных критериев оценки выраженности клеточной экструзии в комплексе с современным арсеналом изучения клеточной пролиферации позволит провести сбалансированную оценку основных количественных параметров внутритканевого гомеостаза эпителия воздухоносных путей в норме и патологии.

About the authors

L. I. Yesev

Yaroslavl’ State Medical Academy

A. V. Pavlov

Yaroslavl’ State Medical Academy

Email: pavlov@yma.ac.ru

References

Supplementary files