ULTRASTRUCTURE OF MOTOR NEURONS AND SYNAPSES IN THE OCULOMOTOR NERVE NUCLEI IN MICE

Full Text

Нейроны глазодвигательной системы мозга, включающей в себя ядра III, IV и VI пар черепных нервов, контролируют быстрые и точные движения глаз, участвуя в саккадических движениях, осуществлении нистагмов и в вестибулоокулярных рефлексах. Организация ядер глазодвигательных нервов (ЯГДН) достаточно подробно исследована у некоторых млекопитающих (кошки, макака-резуса, крысы). Структурно и функционально нейроны этих ядер тесно связаны с другими сенсомоторными образованиями в головном мозгу, такими как вестибулярные ядра, прилежащее ядро, ядро отводящего нерва и др. Биохимическая и физиологическая регуляция активности этих нейронов и афферентные связи с другими структурами головного мозга детально описаны в норме и при заболеваниях различной этиологии [1, 5, 10, 16, 17]. Известно, что в ЯГДН мотонейроны подразделяются на 2 пула [5]. К первому пулу относятся крупные мотонейроны, локализованные в центре ядра и иннервирующие быстро сокращающиеся мышечные волокна с помощью одиночного нервно-мышечного окончания. Их цитоплазма содержит нефосфорилированные нейрофиламенты, парвальбумин и хондроитин-сульфатпротеогликан [7]. Мотонейроны второго пула характеризуются небольшим размером, расположены по периферии ядра, иннервируют с помощью множества нервно-мышечных окончаний медленные, устойчивые к утомлению, мышечные волокна и не участвуют в саккадическом движении глаз, вестибулоокулярных рефлексах, осуществляя, по-видимому, поддержание тонуса мышцы в целом [5]. Крупные мотонейроны ЯГДН иннервируют глазные мышцы и контролируют вращение глаз в вертикальной и горизонтальной плоскости. Между тем, имеется мало информации об ультраструктуре нейронов ЯГДН у мышей (широко распространенного объекта нейробиологических и биомедицинских исследований) как у интактных, так и после стрессорных воздействий. Имеющиеся публикации содержат данные только гистологических и иммуногистохимических исследований ЯГДН у мышей [13, 14, 18]. В связи с этим цель настоящей работы - электронномикроскопическое изучение крупных мотонейронов ЯГДН у мышей. Материал и методы. Работа выполнена на 5 самцах мышей С57 Black/6 (массой 20-25 г) с соблюдением «Правил проведения работ с использованием лабораторных животных». Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации. Материалом для исследований служили фронтальные полоски головного мозга (по одной от каждого животного), содержащие ЯГДН. Выделение нужных участков производили по реперным структурам мозга между мозжечком и полушариями большого мозга, причем главными ориентирами были пластинки четверохолмия и центральное серое вещество среднего мозга. Вырезанные участки мозга фиксировали погружением в раствор альдегидного фиксатора, традиционно используемого в лаборатории при изучении нервной ткани, на 12-16 ч. Основными компонентами фиксатора были формальдегид и глутаральдегид на 0,1 М како-дилатном буфере [2]. Блоки дополнительно фиксировали 2% раствором четырехокиси осмия на том же буфере в течение 4 ч, обезвоживали в этаноле возрастающих концентраций и ацетоне и после заливки в эпон для идентификации исследуемых ядер на микротоме Pyramitome LKB 11800 (KB, Швеция) готовили серийные гистологические срезы толщиной 5 мкм, которые изучали под световым микроскопом NU-2E (Carl Zeiss, ГДР). Главным критерием поиска местоположения исследуемых ядер была ориентировка по форме и взаиморасположению реперных структур - центрального серого вещества среднего мозга, среднего мозга водопровода, медиальных продольных пучков и т. д. Собственно идентификацию ЯГДН проводили, сопоставляя данные различных стереотаксических атласов, применяемых в изучении головного мозга мышей [8, 9, 11]. Для дальнейшего электронно-микроскопического исследования выбирали срезы, содержащие крупные мотонейроны ЯГДН, переклеивали их на чистый эпоновый блок по методу, разработанному в лаборатории [2], и с него получали ультратонкие срезы на ультрамикротоме Leica EM UC6 (Leica, ФРГ). После контрастирования уранилацетатом и цитратом свинца срезы просматривали в электронном микроскопе ВS-500 (Тesla, Чехословакия). Съемку вели на фотопленку, информацию получали, анализируя электронные изображения фотонегативов, оцифрованные с помощью сканера Epson V700 (Seiko, Япония). Морфометрическое исследование проводили вручную на оцифрованных изображениях гистологических и ультратонких срезов. На уровне световой микроскопии для определения размеров клеток применяли оцифрованную шкалу объектмикрометра ОМО (Россия) с ценой деления 10 мкм. На электронно-микроскопическом уровне производили перерасчет значений (размеров синапсов и их компонентов), исходя из увеличения электронного микроскопа (10 000 либо 14 000) и цифрового разрешения изображений сканированных фотонегативов. Результаты исследования. Гистологическое изучение ткани мозга показало, что в месте локализации ЯГДН (рис. 1, а) видны 2 пула нейронов. Это крупные мотонейроны диаметром 20-30 мкм, которые в дальнейшем использовали для электронно-микроскопического изучения, и окружающие их более мелкие нейроны до 10-12 мкм в диаметре (см. рис. 1, б). При электронно-микроскопическом анализе мотонейронов выявлено, что в изучаемом участке крупные нейроны близко расположены друг к другу (рис. 2, а). В соме нейрона имеется большое ядро с глубокими инвагинациями. В цитоплазме расположена гранулярная эндоплазматическая сеть, цистерны которой часто имеют разветвления (см. рис. 2, а). Непосредственно под плазмолеммой нейрона встречаются цистерны разной протяженности, разделенные электронно-плотным материалом (см. рис. 2, б). Имеются аксосоматические синапсы размером до 2 мкм (см. рис. 2, в). Эти синапсы формируют с плазмолеммой нейрона несколько синаптических уплотнений, разделенных небольшими промежутками (см. рис. 2, г). От сомы нейронов может отходить шипик с ножкой (см. рис. 2, г). Встречаются также синапсы по ходу (en passant). Пресинаптическая часть синапса заполнена небольшими электроннопрозрачными синаптическими пузырьками. Среди них встречаются и крупные пузырьки, и пузырьки с электронно-плотным содержимым, а также опушенные пузырьки (см. рис. 2, в, г). В постсинаптической части можно видеть субконтактные округлые синаптические уплотнения, которые были упомянуты ранее, размером до 30 нм. Они находятся на некотором расстоянии (70 нм) от постсинаптической мембраны (см. рис. 2, г). В нейропиле в большом количестве располагаются аксодендритные синапсы (рис. 3). Поперечные и продольные сечения дендритов содержат небольшое количество микротрубочек и элементы агранулярной эндоплазматической сети (см. рис. 3, а, в), а также митохондрии. С одним профилем дендрита могут формировать контакты несколько аксонных окончаний. Синапсы встречаются в основном асимметричного типа с отчетливо выраженным постсинаптическим уплотнением (см. рис. 3, а-в). Так же, как и в аксосоматических синапсах, здесь можно видеть субконтактные уплотнения, расположенные на расстоянии от постсинаптического уплотнения (см. рис. 3, а, б). В этом месте, где есть такие уплотнения, синаптическая щель расширена до 30 нм (см. рис. 3, а). Эти расширения чередуются с участками, где синаптическая щель сужается более чем в 2 раза. В пресинаптических частях аксодендритных синапсов пузырьки электронно-прозрачные, плеоморфные, часто встречаются опушенные пузырьки и пузырьки с электронно-плотным содержимым. Можно было видеть аксодендритные - аксошипиковые синапсы, у которых прослеживается ножка, отходящая от дендрита (см. рис. 3, в). Чаще в плоскость среза попадают только головки шипиков. В случае аксошипикового синапса головка шипика образует довольно протяженный контакт с пресинаптическим окончанием (см. рис. 3, в). Шипиковый аппарат не прослеживается. Среди специализированных контактов в одном синапсе можно встретить в соседстве с активной зоной десмосомоподобный контакт (puncta adherentia), пронизанный фибриллярными структурами (см. рис. 3, г). Обсуждение полученных данных. Изучение мотонейронов ЯГДН у мышей показало, что ультраструктурные признаки, характерные только для этого вида животных, по всей вероятности, отсутствуют. Все установленные признаки присущи мотонейронам ЯГДН и их синаптической организации, описанным ранее у приматов [17], кошек [10] и у форели [12]. По имеющимся литературным данным «серийные синапсы», когда одно синаптическое окончание образует контакт с другим окончанием, являющимся пресинаптическим для третьего, были обнаружены в нейропиле ЯГДН у приматов в большем числе, чем у кошек, подчеркивая более значимую роль пресинаптического торможения в контроле над движением глаз у приматов [17]. В отличие от этих результатов синапсы такого типа мы не нашли в изученном нами материале. Нам не удалось также обнаружить синапсы, имеющие щелевые контакты, что указывало бы на существование материального субстрата электротонической передачи в основе быстрых движений глаз, и этим наши данные не отличаются от уже имеющихся результатов, полученных на макаках [17]. Ранее в электрофизиологических экспериментах в мотонейронах спинного мозга у лягушки была продемонстрирована электрическая связь [6], хотя морфологически специализированные мембранные структуры обнаружены не были [15]. Поэтому было предположено, что морфологическим субстратом электротонической проводимости могут служить не только щелевые контакты, но и близко расположенные мембраны достаточно большой протяженности без включения глиальных клеток. Также высказываются предположения, что материальным субстратом электротонической передачи могут служить и другие специализированные структуры, например длинные дендро-дендритные мембранные контакты без вмешательства глиальных структур и без специализированных структур, описанные между дендритами глазодвигательного и блокового ядер у лягушки. Они могут служить морфологическим субстратом синхронизированного сокращения билатеральных глазных мышц и обеспечивать электротоническую связь между этими мотонейронами [4]. Кроме того, структурным аналогом электрического синапса может быть контакт между плазмолеммами нейронов с шириной щели до 7-9 нм, а также близкое расположение соседних дендритных мембран [12]. По нашим данным, роль морфологического субстрата электротонической связи, помимо щелевых, могут выполнять и десмосомоподобные контакты, описанные в настоящей работе и изученные нами ранее на примере смешанных синапсов на латеральном дендрите маутнеровского нейрона золотой рыбки, входящие, наряду со щелевыми контактами и активными зонами, в состав смешанных синапсов. Десмосомоподобные контакты и мостики в их щели включают актин, как мы показали с помощью маркировки фаллоидином, меченным золотом. При этом оказалось, что размеры десмосомоподобных контактов и число мостиков в щели контакта коррелировали с уровнем электротонической связи за счет дополнительной полимеризации актина [3]. Поэтому мы предположили, что десмосомоподобный контакт может выполнять не только механическую функцию. Полученные результаты можно использовать при исследованиях ЯГДН с позиций их вовлечения в осуществление оптокинетического нистагма при нарушенном сенсорном (вестибулярном или зрительном) афферентном притоке, в частности, длительном пребывании в условиях микрогравитации во время космического полета или продолжительного выполнения оптокинетической реакции во время соответствующей зрительной стимуляции. Работа поддержана грантом РФФИ (№ 12-04-00699а). Авторы благодарят сотрудника Иститута медикобиологических проблем РАН И. Б. Краснова и сотрудника Института биофизики клетки РАН И. В. Нестерову за консультации и неоценимую помощь в проведении работ.

About the authors

R. Sh. Shtanchayev

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: rshtanch@mail.ru
Laboratory of Neuron Ultrastructure

I. B. Mikheyeva

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: mikhirina@mail.ru
Laboratory of Neuron Ultrastructure

N. A. Pen’kova

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: kokanchik@rambler.ru
Laboratory of Neuron Ultrastructure

L. L. Pavlik

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: pavlikl@mail.ru
Laboratory of Neuron Ultrastructure

References

Supplementary files