A COMPARATIVE STUDY OF CATECHOLAMINERGIC AND NITROXIDERGIC VASOMOTOR NEURONS IN THE NUCLEI OF THE CAUDAL PART OF THE BRAINSTEM OF THE RAT

Full Text

В центральной регуляции кровообращения ведущая роль традиционно отводится моноаминергическим механизмам бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра, деятельность которых обеспечивается небольшими группами норадреналинергических нейронов, расположенными между ядрами каудальной части ствола мозга [5, 12, 20, 23]. Имеются сообщения, что на центральные вазомоторные эффекты симпатической нервной системы модулирующие влияния оказывает оксид азота (NO): экспериментальные воздействия, вызывающие повышение или снижение концентрации этой сигнальной молекулы, неизменно приводят к изменениям электрической активности симпатических нервов и гемодинамическим сдвигам [11, 21]. Наличие в вазомоторных ядрах многочисленных NO-ергических нейронов и преобразования, проходящие с ними в процессе развития артериальной гипертензии [2, 3], также дают основание предполагать участие NO в центральных механизмах регуляции гемодинамики. Однако ни в приведенных выше, ни в других аналогичных сообщениях не содержится сведений о количественном распределении катехоламин (КА)-и NO-ергических нейронов в ядрах, известных своими вазомоторными функциями, в связи с чем нами проведено настоящее исследование. Материал и методы. Работа выполнена в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР) на 12 крысах линии Вистар массой 200-250 г, содержавшихся в условиях лабораторного вивария на стандартном рационе. Животных выводили из эксперимента передозировкой 3% раствора тиопентал-натрия, извлекали из полости черепа головной мозг, отделяли от него продолговатый мозг, который фиксировали при 4 ºС в течение 4 чв 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1 М натрийфосфатном буфере (рН 7,4), после чего в течение 24 ч промывали в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (рН 7,4). Фиксированный материал пропитывали холодным 30% раствором сахарозы на 0,1 М фосфатном буфере, готовили криостатные срезы толщиной 30-40 мкм. Затем препараты обрабатывали для иммуноцитохимического выявления тирозин гидролазы (ТГ) - фермента, участвующего в синтезе КА [21], и нейрональной формы NO-синтазы (nNOS), которая в физиологических условиях является морфологическим маркером NO в нервных клетках [13, 14]. Для этого срезы последовательно инкубировали с 1% нормальной сывороткой лошади в течение 1 ч при комнатной температуре, с кроличьими поликлональными антителами к nNOS (Cayman, США) в разведении 1:100 или к ТГ (Immunotech, Франция) в разведении 1:200 при температуре 4 ºС в течение 18 ч, с биотинилированными антителами козы 1:100 (Vector Labs, США) 2 ч при комнатной температуре и с авидинпероксидазным комплексом (Vectastain Ellite ABC Kit, Vector Labs, США) 1 ч при комнатной температуре в темноте. Чтобы выявить продукты реакции, срезы инкубировали с субстратом для обнаружения пероксидазы (VIP Substrate Kit, Vector Labs, США) под контролем микроскопа. Затем срезы промывали, обезвоживали по стандартной методике и заключали в бальзам. Контроль специфичности реакций проводили путем исключения стадии инкубирования в специфической антисыворотке. На контрольных срезах иммунопозитивная реакция отсутствовала. Препараты просматривали под световым микроскопом (Carl Zeiss, Германия) со встроенным осветителем, соединенным с фотокамерой Sony Сyber-shot DSC-HX5V (с разрешением матрицы 10,0 Mega Pixels) в положении трансфокатора - 3х. Изучали ядро солитарного тракта (ЯСТ), двойное ядро (ДЯ), спинномозговое ядро тройничного нерва (СПМЯ) и ретикулярные ядра: гигантоклеточное (РГЯ), парагигантоклеточное (РПГЯ), мелкоклеточное (РМЯ), латеральное (РЛЯ), оральное (РОЯМ) и каудальное (РКЯМ) ядра моста. Для этого из серии последовательных срезов один окрашивали метиленовым синим, на втором - выявляли ТГ, на третьем - nNOS. Затем, используя компьютерный метод совмещения изображений [9], определяли в пределах границ каждого ядра точное местоположение КА- (ТГ-позитивных) и NO-ергических (nNOS-позитивных) нейронов. В проекции среза исследуемых ядер находили среднюю площадь профильного поля нейронов (мкм2), их общее количество при окраске препаратов метиленовым синим и долю, приходящуюся отдельно на ТГ-и nNOS-позитивные нейроны [7, 23]. Пиксельным методом вычисляли средний показатель оптической плотности преципитата в нейронах (СПОП) в соответствии с алгоритмом, описанным нами ранее [8]. Все нейроны были разделены на 3 группы: мелкие (с площадью профильного поля до 250 мкм2), средние (251-680 мкм2) и крупные (свыше 681 мкм2). Количественное исследование проводили, используя не менее 10 последовательных срезов каждого ядра и компьютерные программы АСАИ Allegro-MC [1], полученные данные представляли в виде среднего значения и его стандартной ошибки. Оценку статистической значимости цифровых данных проводили по t-критерию Стьюдента. Различия считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. В проекции ядер выявляются ТГ-и nNOS-позитивные нейроны с различными формой, размерами, плотностью расположения и интенсивностью реакции (рис. 1, а-г). В обоих типах клеток в зависимости от концентрации ферментов гранулы преципитата окрашивают цитоплазму в различные оттенки коричневого цвета. Бóльшая часть тел иммунопозитивных нейронов в исследованных ядрах имеют треугольную или веретеновидную форму, выявляются также полигональные и реже звездчатые клетки. При этом ТГ выявляется в телах и отростках как мелких, так и крупных клеток (см. рис. 1, а, б), nNOS находится, преимущественно, в телах нейронов небольшого размера (см. рис. 1, в, г). В РГЯ, РПГЯ, РКЯМ встречаются очень крупные нейроны площадью около 2000 мкм2, которые выявляются при реакции на ТГ, но не маркируются nNOS. Отмеченные особенности локализации указанных выше ферментов в клетках исследованных размерных групп находят отражение в различиях соотношения долей мелких, средних и крупных ТГ-и nNOS-позитивных в изученных нами ядрах (рис. 2). Несмотря на то, что в обоих случаях в большинстве ядер преобладают мелкие нейроны, на их долю приходится 72-88% nNOS-позитивных нейронов и только 45-58% ТГ-позитивных. Особенно часто небольшие по размерам нейроны выявляются в ядрах, известных своими сенсорными или ассоциативными функциями (ЯСТ, РМЯ, РЛЯ, СПМЯ), в которых крупных клеток, содержащих ТГ, встречается в 3-4 раза меньше, чем в двигательных ядрах. Среди nNOS-позитивных нейронов они встречаются еще реже, не превышая 1-3% от общего числа иммунопозитивных клеток. В двигательных ядрах (РГЯ, РПГЯ, РКЯМ) доля крупных ТГ-позитивных нейронов колеблется от 18 до 28%, nNOS-позитивных нейронов - от 6 до 8%. Исключение составляют ДЯ и РОЯМ: в первом - доля крупных ТГ-позитивных нейронов превышает 60%, зато мелких клеток - не достигает и 30%, во-втором, напротив, содержание крупных нейронов не столь велико, как в остальных двигательных ядрах, хотя мелкие нейроны встречаются в нем на 5-12% чаще. Подсчеты показывают, что подавляющее число ТГ-позитивных нейронов находятся в РГЯ, РПГЯ, РКЯМ, РЛЯ и ЯСТ. Их доля в этих ядрах колеблется между 8-15% (рис. 3, а), в них определяется и наиболее интенсивная реакция (см. рис. 3, б). Однако и в тех ядрах, в которых численность ТГ-позитивных нейронов сравнительно высока, на разных уровнях сечения ядер они располагаются крайне неравномерно. В РГЯ, например, нейроны, маркированные ТГ, концентрируются в основном в центральной части ядра, где наблюдается до 30 крупных клеток с интенсивной реакцией и длинными аксонами, по ходу которых образуются многочисленные варикозные утолщения (см. рис. 1, б). На некоторых срезах, учитывая невысокое содержание клеток, выявляемых метиленовым синим, доля ТГ-позитивных нейронов достигает 21%. В ЯСТ основное количество ТГ-позитивных нейронов определяется в вентромедиальной области его каудальной и центральной частей, где их доля достигает 15%, хотя в среднем в ядре величина этого показателя почти в 2 раза ниже. В краниальной части этого ядра в основном выявляются иммунопозитивные нервные волокна. Клетки, хотя и в ограниченном количестве, встречаются здесь, преимущественно, в области, примыкающей к центральной части ядра. В других исследованных ядрах (РМЯ, СПМЯ, ДЯ, РОЯМ) содержание ТГ-позитивных нейронов колеблется от 1 до 3%, а значения СПОП в них в 2-3 раза ниже, чем в указанной выше группе ядер. В отличие от ТГ- nNOS-позитивные нейроны в этих ядрах располагаются относительно реакцией, в связи с чем в этих ядрах определяется и высокий СПОП (см. рис. 3, а, б). При этом, наиболее значительные различия величины показателей между двумя исследованными ферментами определяются в РМЯ и СПМЯ, в которых и доля nNOS-позитивных нейронов, и концентрация в них nNOS намного превышают соответствующие показатели ТГ-позитивных нейронов. В двух других ядрах (ЯСТ, РЛЯ) также преобладают nNOS-позитивные нейроны, но указанные различия выражены в меньшей степени: в ЯСТ экспрессия nNOS наблюдается в 12,6% нейронов, ТГ - в 8,3%, в РЛЯ - в 18,2 и 10,7% соответственно. В некоторых двигательных ядрах (РГЯ, РПГЯ, РКЯМ), наоборот, доля nNOS-позитивных нейронов и СПОП превышает соответствующие значения, установленные для nNOS-позитивных нейронов, в других (ДЯ, РОЯМ) - содержание двух изученных типов нейронов существенно не различается, хотя концентрация ТГ в этих ядрах выше, чем nNOS (см. рис. 3, а, б). Обсуждение полученных данных. Имеются немало экспериментальных доказательств, что источником центральных симпатических нервных влияний являются каудальные отделы ствола мозга [5, 11, 23]. Еще в середине прошлого века в указанных областях мозга было выявлено несколько компактных клеточных скоплений норадреналинергических нейронов (А1- А7), которые располагались между ретикулярными, висцеросенсорными и моторными ядрами [12]. Эти находки послужили аргументом для обоснования той важной роли, которая отводилась симпатической иннервации в центральных механизмах управления гемодинамикой. Впрочем, позднее были представлены доказательства, что общее число таких клеток в «главной вазомоторной области мозга» крайне незначительно и составляет, по разным оценкам, от 1 до 3% [7, 10, 22], что вызвало обоснованное сомнение в их решающем значении в регуляции кровообращения. Однако локализация ТГ-позитивных нейронов не ограничивается известными клеточными скоплениями. Иммуногистохимической реакцией на ТГ моноаминергические нейроны были обнаружены в ЯСТ, где их количество по подсчетам разных исследователей составляло около 12-18% [19, 20]. Убедительных данных о наличии и численности ТГ-позитивных нейронов в других вазомоторных ядрах, принимающих активное участие в механизмах регуляции кровообращения, мы не встретили. Восполняя этот пробел, мы провели сравнительное изучение топохимии и количественного распределения ТГ-позитивных нейронов, расположенных в ядрах вентролатеральной и медиальной областей продолговатого мозга и моста. Результаты исследования показали, что из более двух десятков находящихся здесь ядер с установленной вазомоторной функцией подавляющее число ТГ-позитивных нейронов (от 8 до 14%) определяется в РГЯ, РПГЯ, ЯСТ, РЛЯ и РКЯМ, хотя и в этих ядрах доля выявленных клеток на разных уровнях их сечения существенно различается. Например, в РГЯ они в основном сосредоточены в центральной части, где совместно с нейронами РПГЯ участвуют в образовании пути, обеспечивающего распространение возбуждения от медиальной зоны бульбарного отдела сердечнососудистого центра к симпатическим нейронам промежуточно-латерального ядра спинного мозга [15, 18]. В других ядрах (РМЯ, СПМЯ, ДЯ, РОЯМ) ТГ-позитивные нейроны встречаются в несколько раз реже, где на их долю приходится не более 3%. При этом, в довольно большой группе вазомоторных ядер ТГ-позитивные нейроны постоянно не выявляются. Вместе с тем, существуют механизмы, способные увеличить зону воздействия нейрона, компенсируя тем самым дефицит клеток, продуцирующих тот или иной медиатор. Один из таких механизмов хорошо известен: это способность некоторых химических веществ выступать в качестве нейромодуляторов, модифицирующих действие нейромедиаторов. Имеются большое количество экспериментальных доказательств тесного взаимодействия газотрансмиттерных систем мозга с классическими нейромедиаторами. Подавление или, наоборот, усиление синтеза NO в ЯСТ, а также в некоторых ядрах вентролатеральной области ретикулярной формации продолговатого мозга сопровождаются изменениями тонуса симпатической нервной системы и гемодинамическими изменениями [11, 21]. Оказывая нейромодуляторное действие на нейроны, вовлеченные в обмен классических медиаторов, NO-ергические нейроны участвуют в формировании сложных сетей, управляющих интеграционными процессами в мозгу. Приведенные выше факты дают серьезные основания полагать, что nNOS-позитивные нейроны играют важную роль в механизмах регуляции гемодинамики именно благодаря тесному взаимодействию с моноаминергической системой мозга. Для такого заключения имеются и морфологические предпосылки: в ЯСТ, например, наряду с ТГ-позитивными, выявляются до 14% NADPHd-позитивных нейронов, часть из которых (около 8%) колокализованы с ТГ-иммунопозитивными клетками [10, 19], хотя, по другим данным, в стволе мозга у крыс только 3% ТГ-позитивных нейронов имеют совместную локализацию с нейронами, содержащими nNOS [13]. Учитывая, что локализация и количественное распределение NADPH-d и nNOS в ранее изученных нами ядрах довольно часто не совпадают [6, 7], для выявления NO-нейронов мы использовали более специфичную иммуногистохимическую реакцию на nNOS. Данные сравнительного анализа показали, что в ядрах, в которых нами обнаружено ограниченное количество ТГ-позитивных нейронов, как правило, нейроны с экспрессией nNOS встречаются чаще. Особенно много nNOS-позитивных нейронов в РМЯ, РЛЯ, РОЯМ, где на их долю приходится от 16 до 28%. Интенсивность реакции в nNOSпозитивных нейронах этих ядер также выше, чем в РГЯ, РПГЯ и РКЯМ, в которых больше клеток, имеющих крупные размеры и невысокую концентрацию фермента. Впрочем, клеток, участвующих в обмене газотрансмиттеров, может быть немного, поскольку эти вещества проявляют свое действие не как классические нейромедиаторы через поверхностные рецепторы клеток-мишеней, а как объемные нейропередатчики, создающие вокруг себя «поле воздействия» [16, 21]. В такое поле воздействия, помимо ТГ-позитивных нейронов, попадают нейроны и другой медиаторной принадлежности. Не так давно нами представлены материалы о том, что в вазомоторных ядрах продолговатого мозга выявляется около 12-18% серотонинсодержащих клеток, многие из которых находятся в тесных структурных отношениях с nNOS-позитивными нейронами [7, 18]. Серотонинергические нейроны, так же как и ТГ-позитивные, имеют самостоятельные выходы на преганглионарные нейроны спинного мозга и способны оказывать активное влияние на тонус сосудов [4]. Приведенные выше данные показывают, что в пространственные взаимоотношения между вазомоторными ядрами могут быть вовлечены нейроны различной медиаторной принадлежности. Наличие в исследованных нами ядрах ТГ-и nNOS-позитивных нейронов создает необходимый субстрат для реализации разнообразных функций мозга, включая регуляцию гемодинамики

About the authors

V. M. Chertok

Pacific State Medical University

Email: chertok@mail.ru
Department of Human Anatomy

A. Ye. Kotsyuba

Pacific State Medical University

Email: akotc@mail.ru
Department of Human Anatomy

References

Supplementary files