INTERSTRAIN AND SEASONAL DIFFERENCES IN THE RESPONSE OF BLOOD AND ORGANS OF THE IMMUNE SYSTEM TO ROUND-THE-CLOCK ILLUMINATION OF CBA AND C57/BL6 MICE

Full Text

В экспериментальной медицине выведены животные с различным генотипом, являющиеся моделями патологических состояний, встречающихся у людей. Показано, что у экспериментальных животных разных линий уровень ответа на одно и то же воздействие неодинаков [6]. Выраженность и направленность адаптивных реакций определяются, с одной стороны, силой и длительностью стрессорного воздействия, с другой - гено-и фенотипом [5], а также сезоном года [12]. Так, мыши разных линий различаются по способности селезёночных (ТиВ) клеток к спонтанной и стимулированной пролиферации. Самый высокий уровень пролиферации этих клеток отмечен у мышей линии CBA, самый низкий - у C57/BL6 [3]. Рядом авторов выявлены межлинейные различия в реагировании разных систем организма у мышей линий CBA и C57/ BL6 на бактериальные и грибковые агенты [4]. Установлено, что у мышей линии C57/BL6 преобладает Th1-зависимый иммунный ответ [7]. У них по сравнению с мышами линии CBA в шишковидной железе синтезируется значительно меньше мелатонина, что обусловлено низким содержанием фермента n-ацетилтрансферазы, участвующего в синтезе гормона [9, 11]. Мыши этих двух линий стали объектом для исследований влияния круглосуточного освещения (КО) на иммунную систему. Изменение ритма чередования света и темноты оказывает десинхронизирующее действие на клетки иммунной системы у мышей линии CBA, изменяя суточный ритм клеточного состава лимфоидных органов и крови [2]. Однако роль генотипа в определении программы ответа иммунной системы на нарушение светового режима остаётся малоизученной. Цель данного исследования - изучение морфофункциональных особенностей иммунной системы у мышей линий CBA и C57/BL6 при нарушении светового режима в различные сезоны года. Материал и методы. Исследование проведено в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». В эксперименте использованы самцы мышей линий CBA и C57/BL6 в возрасте 4 мес, массой 26-30 г, родившиеся и содержавшиеся в виварии Института клинической иммунологии СО РАМН. В зимнее (декабрь) и весеннее (март) время года по 7 животных каждой линии содержали при световом режиме 12 ч свет:12 ч темнота (12:12) и по 7 животных - при КО в течение 14 сут. На 15-е сутки животных взвешивали, декапитировали под этаминаловым наркозом в утреннее время суток (с 10.00 до 12.00 ч), брали кровь из декапитационной раны и лимфоидные органы (тимус и селезенку). Органы и их кусочки взвешивали. Из кусочков приготавливали клеточную суспензию мягким раздавливанием в стеклянном гомогенераторе. В крови и в суспензии из лимфоидных органов подсчитывали количество всех лейкоцитов. Подсчет проводили в 25 больших квадратах камеры Горяева с последующим пересчетом количества клеток на 1 мл крови или суспензии по общепринятой формуле. Затем вычисляли количество клеток в органе по следующей формуле: А×В/С×Д, где А - количество клеток в 1 мл; В - объем суспензии (мл); С - масса суспендированных клеток (мг); Д - масса органа (мг). С помощью моноклональных антител, меченных флюоресцеин-изотиоционатом (FITC) и фикоэритрином (BD Pharmingen, США), на проточном цитофлуориметре FACS Canto II (Becton Dickinson, США) определяли долю и абсолютное количество субпопуляций лимфоцитов CD3+, CD4+8-, CD4-8+, CD4+8+, CD19+, CD3+hi в тимусе и селезенке. Анализ содержания клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла в исследуемых органах, проводили с помощью метода проточной цитофлуориметрии с применением ДНК-специфического красителя - йодистого пропидия с использованием цитофлюориметра FACS Canto II (Becton Dickiston, США; фильтр 585/42). Были выделены: клетки в фазе G0/G1 - фазе покоя, диплоидные 2n, клетки, находящиеся в состоянии пролиферации (синтетическая фаза S), в постсинтетической и митотической фазах G2/M, гипердиплоидные (>2n), а также гиподиплоидные клетки (<2n), большинство из которых находились в состоянии апоптоза. В тексте статьи приводится содержание соответствующих клеток (%) по отношению к их общему количеству в пробе. Все экспериментальные процедуры выполнены с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации по защите позвоночных животных, используемых для лабораторных и иных целей. Для статистической обработки результатов использовали пакет прикладных программ для ПК «Statistica 7». Определяли среднюю величину показателя и его стандартную ошибку. Различия между показателями в группах оценивали по критерию Вилкоксона- Манна-Уитни и считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. Отличительной особенностью мышей линии CBA от C57/ BL6 является сниженное содержание лейкоцитов в периферической крови в декабре (табл. 1). В тимусе в декабре и марте у мышей линии C57/ BL6 по сравнению с мышами линии CBA было повышенное содержание Т-лимфоцитов: весной у этих животных - выше абсолютное количество всех исследованных субпопуляций Т-клеток, относительное содержание CD3+, CD3+hi, Т-хелперов/ индукторов (CD4+8-), незрелых Т-лимфоцитов (CD4+8+). В это же время у мышей линии CBA была повышена, вероятно компенсаторно, пролиферативная активность тимоцитов (гипердиплоидные клетки: >2n) (см. табл. 1). В селезёнке наиболее заметны межлинейные различия в субпопуляционном составе лимфоцитов в зимнее время года, когда абсолютное количество исследованных Т-иВ-клеток выше у мышей линии C57/BL6 (табл. 2). Весной у мышей линии C57/BL6 по сравнению с CBA отмечена значимо более высокая пролиферативная активность клеток в этом органе (гипердиплоидные клетки: >2n) (см. табл. 2). Вне зависимости от сезона года доля Т-клеток (CD3+), Т-хелперов/ индукторов (CD4+8-) и абсолютное количество эффекторно-киллерной субпопуляции (CD4-8+) повышена у мышей линии CBA (см. табл. 2). При КО в зимний сезон изменения клеточного состава органов иммунной системы у оппозитных линий животных были также различны. В тимусе у мышей линии CBA зимой при нарушении светового режима лишь снизилось относительное содержание Т-лимфоцитов эффекторнокиллерной субпопуляции (СD4-8+). В весенний же сезон у животных линии CBA под влиянием КО увеличились количество клеток в тимусе, доля Т-клеток (CD3+, CD3+hi), относительное и абсолютное содержание Т-хелперов/индукторов (CD4+8-), абсолютное количество незрелых Т-лимфоцитов (CD4+8+) иТ-эффекторов/киллеров (CD4-8+) (см. табл. 1). У животных линии C57/BL6 в декабре под воздействием КО в тимусе снизилась доля эффекторно-киллерной субпопуляции (СD4-8+), а в марте увеличилось абсолютное количество этих клеток. В зимний сезон снизилась доля Т-клеток с высокой экспрессией маркёра CD3 (CD3hi), а весной повысилось относительное содержание и этой субпопуляции, и CD3+ (см. табл. 1). В декабре снизилась доля Т-хелперов/индукторов (CD4+8-). Как в зимний, так и в весенний сезон под воздействием КО у животных линии C57/BL6 повысилось относительное (зимой) и абсолютное (весной) содержание незрелых клеток (CD4+8+). Пролиферативная активность тимоцитов при КО зимой снижалась (гипердиплоидные клетки: >2n), а весной - повышалась (см. табл. 1). Зимой под влиянием КО в периферической крови у мышей линии C57/BL6 количество лейкоцитов становилось больше, чем у животных линии CBA (см. табл. 1). После КО клеточный состав селезёнки в зимний период изменялся преимущественно у мышей линии CBA. У них значимо снижалось общее количество клеток в органе, абсолютная и относительная численность всех исследованных субпопуляций лимфоцитов (CD3+, CD4+8-, CD4- 8+) за исключением относительного содержания В-клеток (CD19+), доля которых увеличивалась (см. табл. 2). В селезёнке у мышей линии C57/ BL6 после КО наблюдалось лишь повышение абсолютного содержания Т-лимфоцитов (CD3+) (см. табл. 2). Весной у оппозитных линий мышей клеточный состав селезёнки в ответ на КО изменялся преимущественно разнонаправленно. У животных линии CBA после воздействия КО наблюдалось увеличение количества клеток в органе и абсолютного числа CD3+, CD19+, CD4+8-, у мышей линии C57/BL6 абсолютное число этих клеток понизилось. У обеих линий снизилось относительное содержание В-лимфоцитов и абсолютное количество Т-эффекторов/киллеров (СD4-8+). В группе мышей линии C57/ BL6 отмечалось также снижение доли CD3+ спленоцитов. Обсуждение полученных данных. Количеству клеток в органах иммунной системы и периферической крови присущи сезонные биоритмы [9]. Так, отличительной особенностью мышей линии CBA от C57/ BL6 является более низкое содержание лейкоцитов в периферической крови зимой. Установлено, что для количества всех лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови характерны сезонные колебания [10], которые зависят от сезонных флюктуаций содержания мелатонина [5]. Несмотря на низкое содержание мелатонина, синтезирующегося в шишковидной железе, у мышей линии C57/ BL6 [9, 11] количество Т-лимфоцитов зимой и весной в тимусе превышает таковое у животных линии CBA. Это может быть проявлением компенсаторного повышения синтеза тимического мелатонина в условиях недостаточности функции шишковидной железы, так как существуют данные о взаимосвязи синтеза гормона в последней и тимусе [8]. В селезёнке наиболее заметны межлинейные различия в субпопуляционном составе лимфоцитов в зимнее время года, когда абсолютное содержание исследованных Т-иВ-лимфоцитов выше у мышей линии C57/BL6. Весной у этой линии животных отмечена значимо более высокая пролиферативная активность спленоцитов (увеличение количества лимфоцитов в фазе >2n, включающих в себя клетки в синтетической, постсинтетической и митотической фазах клеточного цикла). Влияние КО на клеточный состав тимуса в декабре в большей степени проявляется у мышей линии С57/BL6, а на субпопуляционный состав лимфоцитов селезёнки - у мышей линии CBA. Незначительные изменения клеточного состава селезёнки у мышей линии C57/BL6 после содержания их при КО зимой могут объясняться тем, что на фоне генетически обусловленного дефицита мелатонина они слабее реагируют на КО изменением субпопуляционного состава лимфоцитов органа, так как клеточный состав селезёнки, состоящий на 40-50% из B-клеток и только на 25% из Т-клеток, вероятно, преимущественно регулируется системой гипоталамус-гипофиз- надпочечники [1]. Весной у других линий мышей клеточный состав селезёнки прореагировал на КО преимущественно разнонаправленно. У животных линии C57/BL6 и в зимний, и в весенний сезон под воздействием КО в тимусе повысилось относительное (зимой) и абсолютное (весной) содержание незрелых клеток (CD4+8+). Пролиферативную активность тимоцитов КО зимой снижает (лимфоциты в фазе >2n), а весной - повышает. Таким образом, в весенний период под влиянием КО увеличивается абсолютное количество незрелых Т-лимфоцитов (CD4+8+), одновременно повышается пролиферация тимоцитов, что может свидетельствовать о наиболее выраженном воздействии КО на тимус в весенний сезон. Таким образом, сезонные изменения клеточного состава органов иммунной системы в ответ на КО у исследованных нами линий мышей, вероятно, обусловлены особенностями их иммуноэндокринных взаимоотношений. Это следует учитывать в экспериментальной работе с животными разных генотипов в различные сезоны года.

About the authors

A. V. Shurlygina

RAS Siberian Branch Institute of Physiology and Fundamental Medicine

Email: anna_v_s@mail.ru
Laboratory of Chronophysiology

G. I. Litvinenko

RAS Siberian Branch Institute of Physiology and Fundamental Medicine

Laboratory of Chronophysiology

O. B. Gritzyk

RAS Siberian Branch Institute of Physiology and Fundamental Medicine

Laboratory of Chronophysiology

Ye. V. Mel’nikova

RAS Siberian Branch Institute of Physiology and Fundamental Medicine

Laboratory of Chronophysiology

P. A. Avrorov

RAS Siberian Branch Institute of Physiology and Fundamental Medicine

Laboratory of Chronophysiology

M. V. Tenditnik

RAS Siberian Branch Institute of Physiology and Fundamental Medicine

Laboratory of Chronophysiology

V. A. Trufakin

RAS Siberian Branch Institute of Physiology and Fundamental Medicine

Laboratory of Chronophysiology

References

Supplementary files