ИЗУЧЕНИЕ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ХОНДРОЦИТОВ В СУСТАВНОМ ХРЯЩЕ У СОБАК ПРИ УДЛИНЕНИИ СМЕЖНОГО СЕГМЕНТА КОНЕЧНОСТИ

Полный текст

Хондроциты составляют незначительную часть объёма суставного гиалинового хряща, но они играют важную роль, так как обеспечивают поддержание состояния внеклеточного матрикса в процессах нормальной жизнедеятельности и развития дегенеративных заболеваний. Увеличение числа активно пролиферирующих и продуцирующих клеток - основной источник восстановительных процессов в суставном хряще [4]. В исследованиях на животных установлено, что с возрастом в результате апоптоза происходит значительное снижение численной плотности хондроцитов, что интерпретируется авторами как начало остеоартроза [10]. Митотически делящиеся хондроциты обнаруживались до 8 нед постнатального онтогенеза у крыс, при экспериментально индуцированном остеоартрозе митотический индекс приближался к нулю, при этом снижалась и численность хондроцитов [11]. Фигуры митоза хондроцитов и ассоциированный с пролиферацией антиген Ki-67 не выявлялись в нормальном хряще коленного сустава у взрослых людей, однако Ki-67 обнаружен в некоторых образцах суставного хряща у больных с остеоартрозом преимущественно в поверхностной и промежуточных зонах [9]. В прицельном биомеханическом исследовании, проведенном на кроликах, доказано, что в результате натяжения мягких тканей при ортопедическом удлинении голени отчетливо выражена компрессия суставных поверхностей коленного сустава [14]. В модели ex vivo обнаружено моделирующее воздействие механической компрессии на пролиферацию хондроцитов [13]. Сведения о пролиферативных возможностях клеток суставного хряща при ортопедическом удлинении конечности в литературе отсутствуют. Цель настоящей работы - изучение пролиферативной активности хондроцитов в суставном хряще коленного сустава у собак при удлинении голени. Материал и методы. Изучен суставной хрящ наружного мыщелка бедра у 15 подопытных и 5 интактных (контроль) беспородных собак I категории (длина голени 18-21 см) в возрасте 1,5-2 лет и массой 18-25 кг. Содержание и оперативные вмешательства проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказы № 755 МЗ СССР от 12.08.1977 г., № 1179 МЗ СССР от 10.10.1983 г., № 267 МЗ РФ от 19.06. 2003 г.) и принципами Европейской конвенции (г. Страсбург, 1986) [3]. Манипуляции, проводимые на животных, рассмотрены и одобрены этическим комитетом Российского научного центра «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова. Всем подопытным животным после закрытой флексионной остеоклазии берцовых костей методом чрескостного дистракционного остеосинтеза осуществляли дозированное удлинение правой голени на 28 мм по 1 мм за 4 приема (эксперимент выполнен канд. вет. наук С. А. Емановым). Через 28 сут дистракции, 30 сут фиксации и через 30 сут после снятия аппарата после эвтаназии животных передозировкой барбитуратов вскрывали коленный сустав и с передней поверхности наружного мыщелка бедренной кости вырезали кусочки суставного хряща размером 2-3×5-6 мм. Часть материала для изготовления парафиновых срезов обрабатывали по стандартной методике [5]. На срезах, помещенных на стекла с поли-л-лизином, с использованием набора реактивов для иммуногистохимии и системы визуализации RE7140-К, моноклональных антител к Ki-67 (готовые к применению) фирмы «Novocastra» (Великобритания) определяли экспрессию белка Ki-67 согласно протоколу фирмы производителя. Ki-67 - ядерный антиген, экспрессируемый в пролиферативной фазе клеточного цикла (фазы G1, S, G2, M) и отсутствующий в фазе G0. Срезы докрашивали гематоксилином и заключали в канадский бальзам. Ядерная реакция любой интенсивности фиксировалась как позитивная для Ki-67. Индекс Ki-67 (InKi-67) вычисляли как отношение клеток, экспрессирующих этот антиген, к общему количеству подсчитанных клеток, выраженное в процентах. В качестве контроля морфометрировали суставной хрящ у интактных животных. Часть материала после альдегидно-осмиевой фиксации обрабатывали по разработанной нами методике [7] и заключали в аралдит. На ультратоме Nova (LKB, Швеция) изготавливали эпоксидные полутонкие (толщиной 0,5-1,0 мкм) срезы увеличенной площади [6], которые окрашивали метиленовым синим - основным фуксином. Определяли относительные средние значения (в процентах от значений у интактных животных) площади сечения хондроцитов (Sch) и их численной плотности (NAch) в поверхностной, промежуточной и глубокой зонах хряща. Все препараты исследовали, используя фотомикроскоп (Оpton, Германия). Гистоморфометрические исследования выполнены с помощью аппаратно-программного комплекса «ДиаМорф» (Москва) и программы ВТ-Мастер-Морфология (ВидеоТест, Россия). Для анализа цифрового материала использовали описательную статистику. В зависимости от характера распределения и объема выборок значимость различий оценивали с помощью критериев Стьюдента или Вилкоксона и программы AtteStat (тесты запрограммированы И. П. Гайдышевым [1] и помещены в динамически подключаемую библиотеку программы Microsoft Excel 97). Различия считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. При светооптическом исследовании полутонких срезов суставного хряща у интактных собак деструктивные изменения хондроцитов не выявлены. Изредка они обнаруживались в хондроцитах двучленных изогенных групп, преимущественно в верхних слоях промежуточной зоны хряща. В подопытной группе через 28 сут дистракции в поверхностной зоне суставного хряща были отмечены деструктивные изменения: морфологические признаки некроза и апоптоза отдельных хондроцитов, нарушение гомогенности межклеточного вещества - очаги демаскирования коллагеновых волокон. Под такими участками в промежуточной зоне была увеличена частота встречаемости двучленных изогенных групп клеток (рис. 1, а). В части наблюдений отмечено нарушение целостности базофильной линии, проникновение сосудов в хрящ. Обнаруженные изменения хрящевой ткани имели мозаичное расположение, участки с демаскированными коллагеновыми волокнами в суставном хряще чередовались с неповрежденными, имеющими обычную структуру. Через 30 сут фиксации уменьшились частота встречаемости и объем участков с демаскированными волокнами. В поверхностной зоне были выявлены многочленные изогенные группы, состоящие из 8 клеток и более (см. рис. 1, б). Через 1 мес после снятия аппарата сохранялось нарушение организации матрикса хряща поверхностной зоны. Наибольшая частота встречаемости изогенных групп отмечена в промежуточной зоне хряща, где преобладали в основном двучленные изогенные группы клеток (см. рис. 1, в), единичные четырехчленные изогенные группы клеток были отмечены в глубокой зоне. На всех этапах эксперимента фактор пролиферации - белок Ki-67 был выявлен в виде окрашенного в коричневый цвет ядерного субстрата хрящевых клеток преимущественно в верхних слоях промежуточной зоны, а также очагами в поверхностной и глубокой зонах хряща (рис. 2). В суставном хряще у всех экспериментальных животных InKi-67 превышал таковой в контроле, его максимальные значения были зарегистрированы в конце периода дистракции (таблица). К концу дистракции было выявлено значимое снижение численной плотности хрящевых клеток в поверхностной и глубокой зонах хряща (рис. 3, а). Наиболее выраженное уменьшение площади сечения клеток было зарегистрировано в промежуточной зоне (см. рис. 3, б). Здесь же отмечена и преимущественная локализация маркера пролиферации. К концу периода фиксации по сравнению с предыдущим этапом эксперимента выявлено увеличение численной плотности клеток во всех зонах хряща, но особенно в поверхностной и промежуточной зонах и резкое снижение площади сечения хондроцитов в поверхностной зоне. При этом сохранялись высокие значения InKi-67. В поверхностной зоне хряща выявлены многочисленные Ki-67позитивные хондроциты в составе многочленных изогенных групп. Через 1 мес после снятия аппарата численная плотность хондроцитов в поверхностной и промежуточной зонах увеличивалась, при этом хондроциты были уменьшены в размерах. По сравнению с контролем сохранялись высокие значения InKi-67. В глубокой зоне численная плотность клеток резко снизилась, но увеличилась средняя площадь сечения хондроцитов по сравнению с таковыми на предыдущих этапах эксперимента. Обсуждение полученных данных. При удлинении смежного сегмента конечности деструктивные изменения выявлены преимущественно в поверхностной и глубокой зонах суставного хряща. Демаскирование коллагеновых волокон в поверхностной зоне хряща отражает реакцию на избыточную статическую нагрузку, а проникновение сосудов в глубокую зону со стороны субхондральной кости - на нарушение кровоснабжения. К концу эксперимента в глубокой зоне хряща сохранялась сниженная численная плотность хондроцитов. Поскольку хондроциты - единственный тип клеток, формирующих хрящ, то восстановление их численной плотности должно определяться их пролиферацией. Возбуждение пролиферативных возможностей хондроцитов в нашем эксперименте подтверждается морфологически - обнаружением изогенных групп. Несмотря на то, что в эксперименте отмечены тесные клеточные пары, фигуры митозов хондроцитов обнаружить не удалось. M. A.Gómez-Camarillo и J. B. Kouri [11] цитируют многих авторов, которые с помощью различных методов доказали наличие пролиферации хондроцитов в суставном хряще у половозрелых особей при остеоартрозе, однако прямых подтверждений пролиферации - признаков митоза - авторам выявить не удалось. Выявленные в нашем исследовании морфологические признаки некроза и апоптоза хондроцитов соответствовали известным из литературы [2, 12] и свидетельствовали об убыли их популяции. Анализ динамики площади, численной плотности хондроцитов, а также анализ топографии изогенных групп и маркера пролиферативной активности Ki-67 свидетельствовали о том, что в данных условиях эксперимента восстановление популяции хондроцитов происходит за счет пролиферации хрящевых клеток, преимущественно в верхних слоях промежуточной зоны, а также очагами в поверхностной и глубокой зонах. По данным Е. В. Четиной [8], локализация маркеров пролиферативной активности Ki-67 и PCNA в эксплантатах суставного хряща у взрослого быка определялась в средней зоне. При культивировании с пептидом СВ12-2, разрушающим коллаген на 1-е сутки, окрашивание пролиферативных антигенов отмечено в средней и глубокой зонах, на 4-е сутки окрашивание пролиферативных антигенов оставалось интенсивным и включало большее число клеток также и в поверхностной зоне. При моделировании остеоартроза у крыс T. Aigner и соавт. [9] обнаружили маркер пролиферации Ki-67 в поверхностной и промежуточных зонах. M. A.Gómez-Camarillo и J. B. Kouri в суставном хряще у крыс при экспериментально индуцированном остеоартрозе фигуры митоза не обнаружили, но отмечали двуядерные хондроциты и пары тесно расположенных клеток. При этом ряд исследователей [9-11] выявили снижение численной плотности клеток. Aigner и соавт. [9] повышение пролиферативной активности хондроцитов в верхних зонах хряща при остеоартрозе связывают с разрушением коллагена. Аналогичные результаты при культивировании эксплантатов суставного хряща у взрослого быка в присутствии пептида, разрушающего коллаген, получены Е. В. Четиной [8]. В нашем исследовании повышение пролиферативной активности хондроцитов в поверхностной зоне, вероятно, можно рассматривать как компенсаторную реакцию в ответ на нарушение структуры межклеточного вещества - хряща суставной поверхности. К концу эксперимента уменьшались частота встречаемости и объем участков с демаскированными коллагеновыми волокнами, численная плотность хондроцитов в поверхностной и промежуточной зонах превышала таковую в норме, деструктивные изменения не прогрессировали. Таким образом, при удлинении голени в суставном хряще мыщелков бедра отмечено повышение пролиферативной активности хондроцитов с преимущественной концентрацией маркера Ki-67 в верхних слоях промежуточной зоны, а также очагами в поверхностной и глубокой зонах. При этом, по окончании удлинения наблюдалось стойкое увеличение численности хондроцитов по сравнению с таковой в интактной группе в поверхностной и промежуточной, но не в глубокой зонах хряща.

Об авторах

Татьяна Анатольевна Ступина

Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова

Email: StupinaSTА@mail.ru
клинико-экспериментальная лаборатория реконструктивно-восстановительной микрохирургии и хирургии кисти 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6

Михаил Моисеевич Щудло

Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова

Email: m.m.sch@mail.ru
клинико-экспериментальная лаборатория реконструктивно-восстановительной микрохирургии и хирургии кисти 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6

Наталья Анатольевна Щудло

Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова

Email: nshchudlo@mail.ru
клинико-экспериментальная лаборатория реконструктивно-восстановительной микрохирургии и хирургии кисти 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6

Список литературы

Дополнительные файлы