MORPHOLOGICAL CHARACTERIZATION OF OXYS AND WISTAR RAT HIPPOCAMPUS IN THE AGING PROCESS

Full Text

В связи с увеличением продолжительности жизни и старением населения возрастает доля людей со структурно-функциональными изменениями головного мозга, сопровождающимися психологическими и поведенческими расстройствами. В первую очередь, повреждения затрагивают кору большого мозга и лимбическую систему. В значительной степени дегенерации подвержены поля СА1, СА3 и зубчатая извилина гиппокампа [9]. Моделью для изучения возрастных нейродегенеративных нарушений может служить созданная в 70-е годы в Институте цитологии и генетики СА РАН линия крыс OXYS, полученная в результате селекции и инбридинга крыс линии Вистар, чувствительных к катарактогенному воздействию галактозы. Сниженная устойчивость крыс OXYS к окислительному стрессу приводит к развитию катаракты, возрастной хориоретинальной дегенерации, ранней инволюции тимуса [4], остеопорозу. Ускоренное старение мозга у крыс линии OXYS проявлялось развитием поведенческих и когнитивных нарушений уже в 3-месячном возрасте [11]. С возрастом в мозгу крыс этой линии содержание окислительных белков нарастает быстрее, чем у животных линии Вистар [2]. Изучение сосудов головного мозга и параметров мозгового кровотока с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) у 12-месячных крыс линии OXYS выявило структурные и функциональные изменения, в том числе снижение реактивности сосудов [5]. Объективным показателем старения мозга у крыс линии OXYS может служить содержание измененных нейронов. В связи с этим цель настоящей работы - исследование структурных изменений пирамидных нейронов гиппокампа в процессе старения крыс линий OXYS и Вистар. Материал и методы. Работа выполнена на 20 преждевременно стареющих крысах линии OXYS и 20 крысах линии Вистар на базе Центра коллективного пользования «Генофонды лабораторных животных» Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск) с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Все животные были разделены на 4 группы. В 1-ю группу входили крысы линии OXYS в возрасте 4 мес, во 2-ю - в возрасте 18 мес, в 3-юи 4-ю - крысы линии Вистар аналогичного возраста. Животные были ингаляционно анестезированы СО2 и транскардиально перфузированы 10% раствором формалина на фосфатном буфере (рН 7,4). Мозг извлекали и дополнительно фиксировали в том же растворе в течение 1 сут. После фиксации материал обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации, заливали в парафин по стандартной методике и готовили сагиттальные срезы головного мозга толщиной 5 мкм. Для выявления хроматофильного вещества в перикарионах нейронов гиппокампа срезы окрашивали 0,1% крезиловым фиолетовым по Нисслю. На препаратах, полученных от каждого животного, в 10 полях зрения при об. 100, ок. 10 в СА1, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа подсчитывали нейроны с очаговым, тотальным хроматолизом, гиперхромные сморщенные нейроны, гиперхромные нейроны без сморщивания. Для электронной микроскопии головной мозг фиксировали путем транскардиальной перфузии раствором, содержащим смесь параформальдегида (4%) и глутаральдегида (0,5%), приготовленном на основе 0,2М какодилатного буфера (рН 7,4). Материал дополнительно фиксировали в 2% растворе четырехокиси осмия на холоде в течение 3 ч, дегидратировали в этаноле восходящей концентрации, ацетоне, пропиленоксиде и заливали в эпон-812. Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на ультратоме Leica EM UC7 (Leicamicrosystems, Австрия). Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим. Ультратонкие серебристые и бледно-золотистые срезы наносили на сетки-подложки, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, изучали и фотографировали в электронном микроскопе JEM-7A (Jeol, Япония). С помощью окулярной сетки при увеличении 10 000 определяли удельную площадь органелл в пирамидных нейронах (в % от общей площади цитоплазмы). Статистическую обработку результатов проводили при помощи лицензионного пакета программ Statistica 6,0 Windows. Анализ полученных данных осуществляли методами описательной статистики с вычислением медианы (Ме) и интерквартильного интервала (Q1-Q3). Для оценки различий использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия между показателями в исследованных группах животных считали значимыми при Р<0,05. Результаты исследования. При светооптическом исследовании гиппокампа 4-месячных животных выявлено, что у крыс линии OXYS по сравнению с крысами линии Вистар в поле СА1 значимо больше доля нейронов с признаками тотального хроматолиза, гиперхромных нейронов без сморщивания, а в поле СА3 и зубчатой извилине - гиперхромных нейронов без сморщивания. В возрасте 18 мес у животных обеих линий изменения нарастают по сравнению с таковыми в предыдущий срок, но в большей степени у крыс линии OXYS. Так, у последних, по сравнению с крысами линии Вистар, в поле СА1 значимо выше доля нейронов с признаками тотального (рисунок, а), очагового хроматолиза (см. рисунок, б) и гиперхромных сморщенных нейронов, а в поле СА3 - гиперхромных нейронов без сморщивания (см. рисунок, в) и нейронов с признаками тотального хроматолиза. При анализе нейронов зубчатой извилины обнаружено значительное увеличение гиперхромных сморщенных и гиперхромных нейронов без сморщивания у крыс линии OXYS по сравнению с таковым у крыс линии Вистар (табл. 1). При электронно-микроскопическом исследовании пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа у крыс линии OXYS в возрасте 4 мес выявлено набухание митохондрий с просветлением матрикса и частичной фрагментацией крист (см. рисунок, г). Цистерны гранулярной эндоплазматической сети утрачивали характерную для них правильную параллельную ориентацию, были изогнуты, фрагментированы, часть цистерн резко расширены. В некоторых нейронах цитоплазма была почти лишена как описываемой органеллы, так и свободных единичных рибосом и полисом, что создавало типичную картину тотального хроматолиза. Встречались расширение перинуклеарного пространства и увеличение количества ядерных пор. В цитоплазме определялись гранулы липофусцина (см. рисунок, д). У преждевременно стареющих крыс линии OXYS в возрасте 18 мес отмечались бóльшие, чем в предыдущий срок деструкция и повреждение нейронов (см. рисунок, е). Размер митохондрий по сравнению с наблюдаемым у крыс линии Вистар, как правило, меньше, кристы подвержены деструкции, матрикс был электронно-плотным, гомогенизированным, определялся неровный контур наружной и внутренней мембран. В комплексе Гольджи отмечалось расширение и фрагментация цистерн. Лизосомы имели различную величину, интенсивно и гомогенно прокрашивались четырехокисью осмия. В цитоплазме имелись вакуоли различной величины и конфигурации. В некоторых нейронах наблюдалась гипертрофия ядрышек, увеличение в них гранулярного компонента, увеличение количества ядерных пор. Морфометрический анализ пирамидных нейронов в возрасте 4 мес у крыс линии OXYS в отличие от линии Вистар выявил меньшую удельную площадь митохондрий, гранулярной эндоплазматической сети и значимо большую удельную площадь вакуолей и лизосом, в том числе липидных включений. Удельная площадь комплекса Гольджи у исследуемых линий крыс не различалась. В возрасте 18 мес у крыс линии OXYS наблюдалось значительнее выраженное, чем в предыдущий срок и у крыс линии Вистар увеличение в перикарионах нейронов удельной площади лизосом, вакуолей, но снижение удельной площади митохондрий гранулярной эндоплазматической сети. Удельная площадь комплекса Гольджи существенно не изменялась ни в одной из исследуемых групп (табл. 2). Обсуждение полученных данных. Гиппокамп, участвующий в механизмах обучения и консолидации памяти, становится одной из первых структур головного мозга, поражаемых в процессе старения. Проведенное нами исследование нейронов пирамидного слоя гиппокампа у крыс отражает эту возрастную зависимость уве-ны увеличением доли измененных нейронов, их личением числа измененных нейронов у старых гибелью и замещением глиальными элементами животных. Установлено, что возрастные изменения головного мозга морфологически обусловле-[7]. При сравнении крыс линии Вистар и крыс линии OXYS наблюдаются значимые различия в выраженности деструктивных изменений структурных компонентов гиппокампа, развивающихся с возрастом, что свидетельствует об ускоренном старении животных линии OXYS. Так, в период активного проявления ускоренного старения мозга у крыс линии OXYS (возраст 4 мес) среди измененных клеток преобладают гиперхромные нейроны без сморщивания, что функционально интерпретируется как реактивное заторможенное состояние нейрона. В этом возрасте наиболее уязвимым регионом гиппокампа становится поле СА1, о чем свидетельствует увеличение в нем числа нейронов с очаговым хроматолизом, наряду с гиперхромией. Вероятно, этот феномен является результатом длительного раздражения и функционального напряжения нейронов с их последующим истощением и возможным превращением в клетки-тени [3]. Выявленные межлинейные различия по степени изменений пирамидных нейронов в гиппокампе могут свидетельствовать в пользу разной чувствительности к окислительному стрессу крыс исследуемых линий. Повышенный уровень окислительных повреждений белков и липидов регистрируется в мозгу крыс линии OXYS позже, чем становятся заметными фенотипические проявления ускоренного старения их мозга [2]. Потенциально инициировать раннее развитие нейродегенеративных процессов в мозгу у крыс линии OXYS может гипоксия. Как было показано ранее, становление мозга на фоне гипоксии обусловлено задержкой формирования микроциркуляторного русла. К концу 1-го месяца жизни развиваются изменения энергетического метаболизма, типичные для адаптации к гипоксии: увеличено накопление фосфокреатина и его расходование на синтез АТФ [10]. С возрастом адаптивные резервы истощаются, иу 1-годовалых крыс линии OXYS методами МРТ выявляются признаки хронической гипоксии, характерные для ишемии изменения церебрального кровотока [1]. Таким образом, хроническая ишемия неизбежно способствует прогрессированию нейродегенеративных изменений. Нарастающие с возрастом структурнофункциональные изменения митохондрий крыс линии OXYS рассматриваются как один из ключевых факторов их преждевременного старения. В возрасте 3 мес в печени у этих крыс были обнаружены изменения соотношения цитохромов внутренней мембраны митохондрий, снижение активности F1F0-АТФ-синтетазы, дыхательного контроля и скорости фосфорилирования [6]. Структурные изменения митохондрий: деструкция крист, лизис матрикса, снижение объемной и поверхностной плотности митохондрий были выявлены ранее в клетках сетчатки, печени и мышцах [5]. При электронно-микроскопическом изучении пирамидных нейронов гиппокампа начальные проявления деструкции митохондрий и появление гранул липофусцина были отмечены у 4-месячных крыс линии OXYS. Для 18-месячных животных были характерны бóльшая деструкция митохондрий, гранулярной эндоплазматической сети, накопление липофусцина, деформация контуров ядра. Кроме того, существенным изменением являлось накопление липофусцина в цитоплазме нейронов, характеризовавшее необратимые повреждения клетки [8]. Увеличение у крыс линии OXYS относительного содержания лизосом можно рассматривать как проявление усиленной аутофагии, направленной на удаление поврежденных мембран и органелл. При этом, наряду с деструктивными изменениями, в нейронах наблюдались отчетливо выраженные адаптационные, компенсаторные процессы: увеличение складчатости оболочки ядра и числа ядерных пор, гипертрофия ядрышек, смещение их на периферию ядра. Таким образом, выявленные нами в настоящей работе интенсивно нарастающие с возрастом изменения в гиппокампе у крыс линии OXYS убеждают в соответствии использования этих животных в качестве модели для поиска новых способов лечения и профилактики преждевременного старения.

About the authors

K. Yu. Maksimova

Siberian State Medical University

Email: kseniya.maksimova.88@mail.ru
Department of Histology, Embryology and Cytology

S. V. Logvinov

Siberian State Medical University

Email: s_logvinov@mail.ru
Department of Histology, Embryology and Cytology

N. A. Stefanova

RAS Siberian Branch Institute of Cytology and Genetics

Email: stefanovan@mail.ru
Sector of Molecular Mechanisms of Aging

References

Supplementary files