STRUCTURAL ORGANIZATION OF THE PROCESSES OF EPENDYMOCYTES LINING THE LATERAL VENTRICLES OF THE RAT BRAIN

Full Text

Выстилка желудочков головного мозга, в частности, боковых, представлена эпендимой, которая создает барьер между цереброспинальной жидкостью и нервной тканью (ликвороэнцефалический барьер). Несмотря на длительную историю изучения эпендимы, до сих пор существуют сомнения в отношении ее структурной и функциональной однородности [8]. Известно, что в отличие от типичных эпителиальных тканей эпендима не имеет базальной мембраны, и базальные части ее клеток напрямую взаимодействуют с другими клетками нервной ткани, хотя даже и этот факт не является общепризнанным [9, 13]. Показано, что отдельные клетки в составе эпендимы имеют длинные базальные отростки, что дает основание относить их к таницитам [12] либо радиальным глиоцитам [14]. Однако остается неясным, насколько распространены такие клетки и какие клетки в составе выстилки боковых желудочков в действительности имеют радиальные отростки, сходные с отростками таницитов. Наиболее удобным маркером для изучения структурных особенностей эпендимоцитов и их отростков является один из белков цитоскелета - виментин, который всегда присутствует в их промежуточных филаментах [1, 2]. Поэтому целью настоящей работы было определение структурной организации отростков эпендимоцитов, выстилающих боковые желудочки мозга крысы, с применением иммуноцитохимической реакции на виментин и конфокальной лазерной микроскопии. Материал и методы. Работа проведена на взрослых крысах-самцах линии Вистар (n=3), которых содержали и умерщвляли с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Головной мозг был фиксирован в цинк-этанол-формальдегиде [6], обезвожен и залит в парафин обычным способом, его фронтальные срезы толщиной 5 и 10 мкм, соответствующие уровню стереотаксических координат: Брегма +0,2 - Брегма +0,48 мм [15], получали с помощью ротационного микротома RM2125RT (Leica, Германия). Перед постановкой иммуноцитохимических реакций проводили тепловое демаскирование антигена в модифицированном цитратном буфере (S1700, Dako, Дания) [4]. Иммуноцитохимическое выявление виментина проводили с помощью мышиных моноклональных антител (клон V9, Dako, Дания) в разведении 1:100. В качестве вторичных молекул для микроскопии в проходящем свете были использованы реагенты из набора EnVision+ HRP/DAB anti-Mouse (Dako, Дания). Визуализацию продукта реакции антиген- антитело осуществляли хромогеном 3`3-диаминобензидином из набора DAB+ (Dako, Дания). После постановки реакции часть срезов докрашивали гематоксилином. Для конфокальной лазерной микроскопии были использованы биотинилированные антимышиные Fab-фрагменты иммуноглобулинов осла (Jackson Immunoresearh, США) и стрептавидин, конъюгированный с флюоресцентными красителями - индокарбоцианином (Cy3, разведение 1:100; Invitrogen, США) и DyLight 405 (разведение 1:100; Jackson ImmunoResearch, США) [3]. Для того, чтобы отличить отростки эпендимоцитов от отростков субэпендимных астроцитов, в которых иногда может присутствовать виментин [5], была проведена иммуноцитохимическая реакция на глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), входящий в состав промежуточных филаментов астроцитов. Для проведения реакции были использованы поликлональные кроличьи антитела к глиальному фибриллярному кислому белку - GFAP (Dako, Дания). В качестве вторичных реагентов использовали козьи антикроличьи антитела, конъюгированные с флюорохромом BODIPY-FL (Invitrogen, США) и свиные антикроличьи антитела, конъюгированные с тетраметилродаминизотиоцианатом - TRITC (Dako, Дания). После постановки иммуноцитохимических реакций ядра клеток в части срезов докрашивали красителем SYTOX Green (Invitrogen, США) [3], который избирательно связывается с ДНК. Полученные препараты исследовали при помощи конфокального лазерного микроскопа LSM 710 (Zeiss, Германия) с аргоновым лазером (488 нм), диодным лазером (405 нм) и твердотельным лазером (561 нм). Обработку полученных изображений и трехмерную реконструкцию объектов проводили с помощью компьютерных программ LSM Image Browser, Zen-2011 и Zen-2012 (Zeiss, Германия). Результаты исследования. После проведения иммуноцитохимической реакции на виментин иммунопозитивными (виментин-ИП) были все клетки эпендимы боковых желудочков, внеэпендимные эпендимоциты, клетки эндотелия кровеносных сосудов, отдельные астроциты, расположенные в мозолистом теле, клетки мягкой оболочки мозга и клетки, расположенные в области поверхностной глиальной пограничной мембраны основания мозга. Виментин-ИП отростки эпендимоцитов в области субвентрикулярной зоны (СВЗ) многочисленны и разнонаправлены. Часть из них заканчиваются на поверхности кровеносных сосудов и участвуют в формировании периваскулярной глиальной пограничной мембраны. В стриатуме отростки выглядят как небольшие (10-30 мкм) виментин-ИП отрезки, располагающиеся радиально (т. е. под углом 90±5-10º к поверхности желудочка). При конфокальной микроскопии препаратов, окрашенных с использованием антител к виментину и GFAP, отчетливо выявляется структурная и цитохимическая неоднородность отростков, расположенных в субэпендимной области латеральной стенки бокового желудочка. Основания всех отростков эпендимоцитов являются виментинИП, но имеют морфологические различия. У одних клеток отростки формируются при переходе вытянутой базальной части тела в широкие основания отростков. У других клеток отростки не имеют отчетливо выраженной переходной зоны. Они примерно одной толщины (0,6-0,9 мкм) на всем видимом протяжении и начинаются на базальной или базолатеральной поверхности тела клетки (рис. 1). У трети эпендимоцитов в области СВЗ отростки не определяются (см. рис. 1). По цитохимическим особенностям отростки можно разделить на 3 группы в зависимости от наличия в них тех или иных белков промежуточных филаментов - виментина, GFAP или двух этих белков одновременно (виментин/GFAP-ИП). В СВЗ встречаются все типы отростков, они ориентированы в разных направлениях и образуют густую сеть (см. рис. 1), также выявляются тела GFAP-иммунопозитивных (GFAP-ИП) астроцитов, однако тела клеток, которые были бы виментин-ИП или виментин/GFAP-ИП, отсутствуют, за исключением виментин-ИП внеэпендимных эпендимоцитов, встречающихся редко и имеющих характерную форму. Кровеносные сосуды, обнаруживаемые в этой области, оплетены отростками всех трех типов, фрагменты отростков перечисленных типов присутствуют и в нейропиле стриатума. Вдоль средней трети латеральной стенки бокового желудочка встречаются единичные эпендимоциты с длинными виментин/GFAP-ИП отростками, которые заканчиваются на сосудах, и отдельные виментин-ИП отростки. GFAP-ИП отростки и тела клеток в этой области многочисленны, в субэпендимной зоне они образуют сплошной слой и иногда контактируют с эпендимоцитами выстилки желудочка (рис. 2). Среди эпендимоцитов, выстилающих латеральную стенку бокового желудочка, встречаются единичные клетки, содержащие в перинуклеарной области оба белка промежуточных филаментов - виментин и GFAP (см. рис. 1). Обсуждение полученных данных. В результате проведенного исследования были подтверждены полученные нами ранее данные [1, 2], что интенсивную реакцию на виментин дают все клетки эпендимы и внеэпендимные эпендимоциты. Обнаружено, что не все эпендимоциты имеют отчетливо выявляемые отростки. У части этих клеток (около 1/3) такие отростки отсутствуют. Особенности структурной организации отростков позволяют предположить их участие в различных процессах, происходящих в субэпендимной зоне и окружающем нейропиле. Ранее было высказано мнение [11], что в области СВЗ, где у взрослых животных происходят процессы нейроногенеза, пул нейрогенных клеток изолирован отростками астроцитов. Наши данные показывают, что, наряду с астроцитами, эпендимоциты и их отростки могут участвовать в создании микроокружения для нейрогенных клеток в СВЗ. Это заключение следует из взаимного расположения отростков разных типов, наблюдаемых в СВЗ вокруг групп безотростчатых клеток. Клетки с длинными виментин-ИП отростками, уходящими вглубь стриатума, как считают некоторые исследователи [12], являются аналогом радиальных глиоцитов и служат опорой для мигрирующих в стриатум клеток [10]. Нами были обнаружены клетки с отростками, дающими ИП-реакцию на виментин и GPAP одновременно и имеющими связь с кровеносными сосудами. Такие отростки подобны отросткам таницитов III желудочка головного мозга, однако отличаются от них составом промежуточных филаментов цитоскелета. Клетки эпендимы, которым принадлежат эти отростки, могут играть роль особых коммуникативных элементов на уровне гематоликворного барьера. Учитывая некоторое сходство структурной организации выявленных таницитоподобных клеток с радиальными глиоцитами [7, 12], можно предположить участие именно этих клеток в регуляции миграции из СВЗ вновь образованных при нейроногенезе нейробластов. Таким образом, в результате настоящего исследования установлены ряд новых фактов, которые важны для понимания тканевой организации и биологической роли эпендимы желудочков головного мозга. Это: наличие базальных отростков у большинства эпендимоцитов, выстилающих стенки боковых желудочков; существование в составе эпендимы особых виментин-ИП таницитоподобных клеток, участвующих при помощи своего базального отростка в формировании периваскулярной глиальной пограничной мембраны; и присутствие в составе эпендимы типичных эпендимоцитов, у которых часть цитоскелета образована промежуточными филаментами смешанного состава (виментин/GFAP).

About the authors

O. V. Kirik

RAS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

Email: olga_kirik@mail.ru
Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

D. A. Sufiyeva

St. Petersburg State University

Email: rondo-13@mail.ru
Department of Cytology and Histology, Department of Fundamental Problems of Medicine and Medical Technologies

A. V. Nazarenkova

St. Petersburg State University

Email: phucus@mail.ru
Department of Cytology and Histology, Department of Fundamental Problems of Medicine and Medical Technologies

D. E. Korzhevskiy

RAS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

Email: DEK2@yandex.ru
Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

References

Supplementary files