CEREBRAL MICROGLIA AND MICROGLIAL MARKERS

Full Text

Микроглиоциты являются резидентными макрофагами нервной системы и имеют мезенхимное происхождение [21, 36] в отличие от других клеточных элементов нервной ткани, образующихся из нейроэктодермы. В последние несколько лет наблюдается неуклонное возрастание интереса к различным аспектам организации и функционирования микроглии ЦНС. Традиционно микроглию принято рассматривать как ключевой элемент воспалительного процесса, развивающегося в нервной ткани в ответ на многообразные повреждающие воздействия [34, 46]. Однако недавние исследования показали, что функции микроглии охватывают более широкий круг процессов, значительная часть из которых напрямую не связаны с развитием реакции на повреждение и инициацией воспаления. Так, установлено, что микроглия в интактном головном мозгу осуществляет постоянный мониторинг состояния синаптических структур нейропиля и является одним из главных регуляторов синаптической пластичности [68, 70]. Предполагается, что микроглия способна к направленному изменению иммунофенотипа при регуляции функций различных структур головного мозга, а также в процессе развития возрастной и психической патологии [59, 66]. Механизмы этих регуляторных влияний остаются во многом неясными, что обусловлено, отчасти, техническими сложностями, возникающими при визуализации микроглии in situ. В связи с этим возникает потребность в обобщении накопленных многообразных сведений о микроглии и современных методах изучения ее структурной организации. В настоящей статье основное внимание уделено микроглиальным маркерам, а также современным иммуноцитохимическим подходам, используемым для выявления микроглиоцитов и анализа их структурной организации. Характеристика микроглиальных маркеров предварена информацией о происхождении микроглии и терминологии, применяемой при описании различных ее форм (фенотипов). Происхождение микроглии Вопрос о происхождении микроглии долгое время оставался дискуссионным [2, 46]. Большинство исследователей всегда склонялись к мезенхимному происхождению микроглиоцитов, но убедительные доказательства этому первоначально отсутствовали. В конце ХХ в. и в последующие годы были проведены сложные эксперименты с использованием трансгенных и химерных животных, в которых было показано, что непосредственными предшественниками микроглиоцитов являются макрофаги, образующиеся у млекопитающих на ранних стадиях внутриутробного развития в стенке желточного мешка в процессе эмбрионального кроветворения [33]. При установлении кровотока эмбриональные макрофаги попадают в сосуды примитивной мозговой оболочки (meninx primitiva) [17] и мигрируют в закладки структур нервной системы еще до формирования внутриорганного (внутримозгового) сосудистого русла [8, 36]. Было отмечено, что при заселении микроглией конечного мозга эмбриона человека макрофаги концентрируются в области закладки сосудистого сплетения [8], что может иметь непосредственное отношение к трансэпителиальной миграции этих клеток в ликвороносные пространства, наблюдаемой в сосудистом сплетении и у взрослых животных в эксперименте [48]. В постэмбриональный период онтогенеза пополнение популяции микроглиоцитов осуществляется в основном за счет пролиферации уже имеющихся клеток микроглии и их внутриорганных предшественников [36, 47]. Миграции моноцитов в нервную ткань и дифференцировки их в микроглиоциты в обычных условиях не происходит. При этом сохраняется возможность заселения мозга, искусственно лишенного микроглии, новыми клетками костномозгового происхождения [22]. При патологических процессах, сопровождающихся повреждением гематоэнцефалического барьера, дифференцировка новых микроглиоцитов из моноцитов более вероятна [32], но увеличение микроглиальной популяции за счет деления резидентных клеток также возможно [9]. Современные данные о происхождении микроглиоцитов свидетельствуют о близком родстве этих клеток с другими тканевыми макрофагами и иными клетками моноцитарного ряда. Это родство подтверждается и общими закономерностями в экспрессии многих маркеров, присущих как микроглиоцитам, так и другим тканевым макрофагам. Однако для типичных микроглиоцитов (условно называемых покоящимися) характерна несвойственная большинству макрофагов сложность структурной организации. Следует заметить, что в интактном головном мозгу, помимо клеток микроглии, имеются и типичные макрофаги, однако эти клетки расположены вне нервной ткани, макрофаги присутствуют в соединительной ткани сосудистого сплетения и мозговых оболочек, а также являются частью супраэпендимных клеток и клеточных элементов жидкости, заполняющей ликвороносные пространства [7, 48]. Классификация микроглиоцитов (формы микроглии) Микроглиоциты ЦНС представляют собой неоднородную популяцию. Различия между ними были отмечены еще при использовании классических импрегнационных методов их выявления. Первоначально были описаны несколько форм, которые различали по числу и особенностям строения отростков. Это - униполярная, биполярная, мультиполярная и ламинарная формы, а также «гистиоцитарные перициты» [3]. Однако эта терминология не вполне отражает функциональное состояние клетки и неудачна в связи со сходством с морфологической классификацией нейронов. В настоящее время для обозначения основного типа микроглиоцитов, встречающихся в зрелом головном мозгу у млекопитающих и человека, используют термин «рамнифицированные» (или ветвящиеся [20]) - это мелкие, как правило, многоотростчатые клетки, имеющие очень малый объем перинуклеарной цитоплазмы (рис. 1). Первичные отростки этих клеток имеют многочисленные разветвления и различное направление, причем изменение направления отростков происходит с формированием углов, а не плавных изгибов (как, например, у астроцитов [10]). Такие клетки характерны для серого вещества интактного головного мозга. Микроглиоциты белого вещества имеют меньше и не столь ветвистых отростков. Находясь между плотно расположенными миелиновыми волокнами, микроглиоциты нередко приобретают уплощенную или веретеновидную форму [6]. Их отростки - менее ветвящиеся (рис. 2), чем у типичных рамнифицированных микроглиоцитов серого вещества. Особой формой микроглиоцитов являются субэпендимные клетки, контактирующие своими межэпендимными отростками с цереброспинальной жидкостью [5]. При воздействии повреждающих факторов наблюдается увеличение популяции этих клеток [4]. Реакция нервной ткани на повреждение сопровождается трансформацией фенотипа микроглиоцитов и появлением нескольких новых типичных и переходных форм. К ним относят палочковидные (веретеновидные) и многоядерные, амебоидные, гигантские и эпителиоидные микроглиоциты [12, 24]. Для активированной микроглии характерны 3 иммунофенотипа, различающиеся по набору маркеров и, соответственно, роли в воспалительных и регенераторных реакциях [69]. Это - M1 (провоспалительный фенотип), M2a (противовоспалительный фенотип) и M2c (фенотип, характерный для стадии разрешения воспаления и ремоделирования ткани). Изменения в структурной организации микроглии отмечены у человека при старении [11], однако остается неясным, всегда ли они связаны с локальным нейродегенеративным процессом. К сожалению, в настоящее время у исследователей отсутствует единство во взглядах на терминологию, которую следует применять для обозначения различных форм активированных микроглиоцитов. Более четкое разграничение морфологических и функциональных форм микроглиоцитов может быть достигнуто при унификации и комбинировании различных методов иммуноцитохимического маркирования, а также более глубокого понимания роли микроглии в регуляции адаптивных и патологических реакций, происходящих в ЦНС. Микроглиальные маркеры Несмотря на то, что со времени открытия микроглии прошло около 100 лет, микроглиоциты до последнего десятилетия ХХ в. оставались наименее изученными клетками нервной ткани. Недостаточная широта исследований микроглии была обусловлена рядом факторов, немаловажным из которых было отсутствие надежных и селективных методов выявления этой клеточной популяции. Основным способом выявления микроглиоцитов до конца 70-х годов ХХ в. оставалась импрегнация нитратом серебра в различных ее вариантах. Импрегнационные методы (Рио-Ортега, Пенфильда, Белецкого, Миягавы- Александровской), прописи которых подробно изложены в руководстве В. К. Белецкого [1], относятся к группе классических нейрогистологических методик. Однако все импрегнационные методы имеют общие недостатки, которые заключаются в значительной продолжительности протокола и трудоемкости, нестабильности используемых растворов, невысокой специфичности реакций, а также плохой их воспроизводимости. С развитием иммуноцитохимии появилась возможность использовать антитела, выработанные против различных белков, синтезируемых клетками микроглии, которые получили название микроглиальных маркеров. Методы иммуноцитохимии оказались удобнее классических импрегнационных методик, но требуют адаптации к различному биологическому материалу и разным способам фиксации. Один из существенных недостатков иммуноцитохимических методик состоит в иногда трудно прогнозируемой видовой специфичности выявляемых антигенов. Поэтому до недавнего времени отсутствовал единый иммуноцитохимический подход, позволяющий с высокой четкостью и селективностью визуализировать тела и отростки микроглиоцитов у лабораторных животных и человека с использованием одного и того же высокоспецифичного маркера. Возможность для разработки универсального протокола иммуноцитохимического выявления микроглиоцитов появилась с открытием японскими исследователями в 1996 г. белка Iba-1 [39] и определением его микроглиальной специфичности [41]. Белок Iba-1 и его применение в качестве маркера микроглиоцитов Белок Iba-1 (Ionized calcium Binding Adaptor molecule 1) относится к группе кальцийсвязывающих белков. Он имеет молекулярную массу 17 килодальтон и состоит из 147 аминокислот, образующих компактный домен, содержащий 2 кальций-связывающих участка, богатых гидрофобными аминокислотами [72]. Считается, что белок Iba-1 аналогичен охарактеризованным другими исследователями белкам - AIF-1 (allograft inflammatory factor-1), MRF-1 (microglia response factor) и даинтаину [26, 45]. Однако в отношении идентичности этих белков с Iba-1 имеются сомнения [6]. О функциях Iba-1 известно немного. Установлено, что этот белок участвует в реорганизации цитоскелета и изменении конфигурации плазмолеммы - процессах, происходящих при фагоцитозе [54, 55]. Взаимодействие с элементами цитоскелета обусловлено наличием у Iba-1 способности связываться с молекулами актина [58], образующими соответствующие микрофиламенты. Достоинством нового маркера является широкая межвидовая стабильность его антигенных эпитопов, что объясняется значительным консерватизмом аминокислотной последовательности Iba-1 у животных и человека. Так, при сравнении аминокислотных последовательностей белков Iba-1 у мыши и человека обнаруживается их 89% идентичность [72]. Аминокислотные последовательности C-и N-концевых фрагментов Iba-1 обладают уникальностью и не встречаются в других белках [40]. С установлением аминокислотной последовательности белка Iba-1 появилась возможность создавать антитела к этому белку, используя для иммунизации животных синтетические полипептиды, соответствующие различным участкам молекулы Iba-1. Имеющиеся сейчас в распоряжении исследователей антитела (например, кроличьи поликлональные антитела 019-19741, Wako Chemicals и козьи поликлональные антитела ab5076, Abcam) позволяют успешно выявлять микроглиоциты в ЦНС у различных млекопитающих и человека [18, 20, 24, 63]. Белок Iba-1 довольно равномерно распределен в цитоплазме и отростках рамнифицированных (ветвящихся) микроглиоцитов. Изучение влияния фиксации на сохранность антигенной структуры Iba-1 показало, что его антигенные детерминанты хорошо сохраняются как при использовании специальных иммуноцитохимических фиксаторов [14], так и в случае применения обычного 10% формалина [18]. В последнем случае обязательным является использование теплового демаскирования антигена, которое при менее «жесткой» фиксации можно исключить путем увеличения продолжительности инкубации срезов в первичных антителах при повышенной температуре либо при использовании высокочувствительных систем детекции [19]. Очевидным достоинством Iba-1, как селективного микроглиального маркера, является возможность проводить с его использованием трехмерные реконструкции клеток [6] и изучать сложную организацию отростков микроглиоцитов [5]. Белок моноцитов и макрофагов CD68 CD68 - трансмембранный белок, имеющий молекулярную массу 110 килодальтон, обнаруживаемый в моноцитах и тканевых макрофагах (в том числе и микроглиоцитах) у человека [30, 37, 60, 62]. У мышей гомологом CD68 является макросиалин [53]. Оба белка характеризуются высоким уровнем гликозилирования и принадлежат к семейству мембранных лизосомальных белков (LAMP - lysosome-associated membrane proteins) [64]. Первоначально CD68 был определен как белок, связываемый одним из видов антител, которые были выработаны против различных эпитопов макрофагальных антигенов, но функция его не была ясна. В настоящее время считается, что СD68 участвует во взаимодействии макрофагов с липопротеидами низкой плотности и выступает в качестве негативного модулятора иммунных реакций [64]. Против белка CD68 получено несколько клонов широко используемых антител - это KP1, EMB11, Ki-M6, Y1/82A, Y2/131 и PG-M1 [8, 13, 29, 31]. Наиболее высокой селективностью среди них по отношению к тканевым макрофагам (и микроглиоцитам) обладает клон PG-M1 [15, 31], однако узнаваемый этим клоном эпитоп антигена видоспецифичен, что не дает возможности использовать его при изучении микроглии у лабораторных животных. У крысы белок, аналогичный CD68, выявляют при помощи антител клона ED1 [25]. Существенным недостатком белка CD68, как микроглиального маркера, является «пунктирный» характер распределения иммунопозитивного материала в отростках активированных и покоящихся микроглиоцитов, тогда как амебоидные микроглиоциты выявляются достаточно четко. Такие особенности иммуногистохимической реакции не дают возможности изучать структуру отростков и проводить реконструкцию клеток сложной формы. По-видимому, это связано с лизосомальной локализацией данного белка. Тем не менее, CD68 и антиген ED1 нередко применяются в нейрогистологических исследованиях как дополнительные маркеры активированной микроглии. Белок CD11b Белок CD11b - это часть рецептора комплемента третьего типа (CR3), который нередко обозначают как CD11b/CD18, MO1 или Mac-1 [49, 56], хотя это один и тот же белковый комплекс. CR3 относится к интегринам, а молекула CD11b - альфа-субъединица этого интегрина, которая связана с бета-субъединицей - CD18 [57, 67]. Рецептор комплемента, частью которого является CD11b, локализован на плазмолемме нейтрофильных гранулоцитов, большинства мононуклеарных фагоцитов и NK-клеток [23, 44, 67]. Хотя CD11b не является высокоспецифическим микроглиальным маркером, иммуноцитохимическая реакция на этот белок часто используется в качестве основного или дополнительного метода выявления активированной микроглии. У крысы для выявления CD11b в микроглиоцитах чаще всего применяют моноклональные антитела OX-42 [16, 42, 50, 52]. Несмотря на то, что OX-42 - это название клона, который реагирует с эпитопом белка CD11b, нередко название «OX42» присваивают и самому маркеру, что создает некоторые неудобства для понимания функциональной роли исследуемых микроглиальных белков. Существенным недостатком антител OX-42 является неустойчивость выявляемого эпитопа при заливке объектов в парафин, поэтому для маркирования микроглиоцитов с использованием CD11b (OX-42) необходимо использовать вибратомные [50] либо криостатные [16] срезы. Другие маркеры микроглии Среди других микроглиальных маркеров, в первую очередь, следует отметить белки главного комплекса гистосовместимости II класса (MHC II). Микроглиоциты, как и другие тканевые макрофаги, экспрессируют эти белки, причем уровень экспрессии увеличивается при провоспалительной активации клеток и нейродегенерации [71]. При исследовании мозга человека активированную микроглию можно выявить с использованием антител к антигену HLA-DR [65], который относится к подгруппе MHC II. У крысы аналогичный антиген называется RT1B и выявляется (чаще всего) при помощи мышиных антител клона OX-6. В связи с этим в зарубежной литературе иногда можно встретить указание на использование микроглиального маркера OX-6 без разъяснения, какой белок при иммуноцитохимической реакции выявляется. В отдельных исследованиях микроглии [38, 51, 61], наряду с другими маркерами, используют антиген ED2, названный так в соответствии с обозначением клона антител, которые применяются для его выявления [27, 28]. Из других белков, экспрессируемых микроглиоцитами, полезную информацию об их функциональном статусе могут дать ферритин, CD115, CD200, индуцибельная NO-синтаза, F4/80 и Cx3Cr1 [35, 43, 71, 73]. Заключение Таким образом, в настоящее время для выявления микроглии и анализа функционального состояния микроглиоцитов могут применяться разнообразные иммуногистохимические подходы. Однако степень полноты выявляемой популяции микроглиоцитов и качество результатов при использовании различных иммуногистохимических маркеров неодинаковы. Часть маркеров (такие как HLA-DR, ED2, CD68) не вполне подходят для анализа структурной организации микроглиоцитов интактного головного мозга, другие - такие как CD200, ферритин и NO-синтаза недостаточно специфичны. Кроме того, подавляющее большинство антител, доступных исследователям в настоящее время, выявляют только видоспецифические эпитопы микроглиальных маркеров, что ограничивает возможности проведения сравнительных межвидовых исследований. Многообразие и функциональная неоднозначность микроглиальных маркеров порождают резонные вопросы об их адекватности, специфичности и пригодности для проведения морфологического исследования. Представленный анализ литературных источников и собственный опыт авторов позволяют заключить, что из всего множества известных на сегодня маркеров только 2 наилучшим образом подходят для проведения структурного анализа микроглиоцитов как в нормальной, так и в патологически измененной нервной ткани - это Iba-1 и CD11b (OX-42).

About the authors

D. E. Korzhevskiy

RAS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

Email: iemmorphol@yandex.ru
Laboratory of the Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

O. V. Kirik

RAS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

Laboratory of the Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

References

Supplementary files