MORPHOLOGICAL DIFFERENCES BETWEEN THE EFFECTS OF VARIOUS MODES OF PRECONDITIONING AIMED AT CORRECTING THE DAMAGE TO THE HIPPOCAMPAL NEURONS BY SEVERE HYPOBARIC HYPOXIA

Full Text

Гипобарическая (высотная) гипоксия широко распространена в природе (в частности, при подъеме в горы) и может служить в качестве удобной, создаваемой в барокамере, экспериментальной модели для раскрытия механизмов действия различной степени дефицита кислородного снабжения, сопряженного с пониженным атмосферным давлением, на молекулярно-клеточном, органном и организменном уровнях. Установлено, что тяжелая гипобарическая гипоксия (ТГГ) при подъеме в барокамере на высоту 6500-10 000 м вызывает многочисленные функциональные нарушения поведения и когнитивных процессов (памяти, обучения), а также тяжелые структурные повреждения нейронов наиболее уязвимых областей мозга (неокортекса, гиппокампа) [10, 15, 18]. В последнее десятилетие появились доказательства, свидетельствующие о том, что умеренная гипобарическая гипоксия в режимах пре-и посткондиционирования способна подавлять запускаемую ТГГ молекулярную программу нейрональной клеточной гибели и существенно предотвращать развитие структурных и функциональных повреждений мозга [4, 14, 15]. В этих исследованиях протективный эффект обнаружен при 3-кратном прекондиционировании (ПК). Вместе с тем, большой теоретический и практический интерес представляет экспериментальный сравнительный анализ действия и других, различающихся по кратности, режимов ПК. Ранее было показано, что одно-и многократные сеансы ПК оказывают неодинаковое влияние на коррекцию структурных повреждений нейронов гиппокампа крыс, индуцируемых ТГГ к 3-м суткам после ее воздействия (т. е. в ранний период) [8]. Цель настоящей работы - анализ изменений нейронов гиппокампа в отдаленный срок после ТГГ, когда более отчетливо проявляются морфологические последствия этого воздействия у непрекондиционированных крыс и при различных по кратности режимах ПК. Материал и методы. Исследования выполнены на взрослых крысах-самцах массой 200-250 г линии Вистар, содержавшихся в стандартных условиях вивария. При проведении экспериментов соблюдались требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского Сообщества (89/609/ЕЕС) об использовании животных для экспериментальных исследований. Протоколы опытов утверждены комиссией по гуманному обращению с животными Института физиологии им. И. П. Павлова РАН. ТГГ создавали в барокамере проточного типа при атмосферном давлении 180 мм рт. ст. в течение 3 ч. В режиме ПК крысы были подвергнуты умеренной гипобарической гипоксии (давление в барокамере составляло 360 мм рт. ст.) в течение 2 ч за 24 ч до воздействия тяжелой гипоксией. Эксперименты проведены на 5 группах крыс (по 6 животных в каждой). Животные 1-й группы служили в качестве контроля, их помещали на 2 ч в барокамеру, но без изменения атмос ферного давления, крыс 2-й группы - подвергали тяжелой гипоксии, на животных 3-, 4-йи 5-й групп перед тяжелой гипоксией оказывали 1-, 3-и 6-кратное ПК-воздействие. Интервал между сеансами у крыс 4-йи 5-й групп составлял 24 ч. Через 7 сут после ТГГ крыс декапитировали и извлекали головной мозг, который фиксировали в 4% параформальдегиде, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 24 ч, и заливали в парафин по стандартному протоколу. Изготавливали серии фронтальных срезов мозга толщиной 7 мкм на уровне -2,8 мм от брегмы, монтировали их на предметные стекла и окрашивали в 0,1% растворе толуидинового синего по методу Ниссля. Полученные срезы исследовали с использованием морфометрической установки, состоящей из светового микроскопа Olympus CX31 (Olympus, Япония), цифровой камеры Progres CT1 (Jenoptic, Германия) и компьютера IBM PC с программным обеспечением «ВидеоТест Мастер Морфология» 5.2 (разработка ООО «Видео Тест», Санкт-Петербург, Россия). С помощью компьютерной программы «Видеотест Мастер Морфология 5.2» в полях СА1 и СА4 гиппокампа у крыс всех групп на протяжении примерно 450 мкм подсчитывали нейроны, оптическая плотность которых попадала в интервал от 0,15 до 0,45 усл. ед. яркости относительно показателя яркости фона соответствующего препарата. Результаты исследования. Через 7 сут после ТГГ были выявлены существенные различия в строении нейронов у непрекондиционированных, а также у 1-, 3-и 6-кратно ПК-крыс как в дорсальном (СА1), так и вентральном (СА4) отделах гиппокампа. ТГГ индуцировала экстенсивные морфологические повреждения в полях СА1, СА4 и вызывала селективную гибель нейронов (до 30-40% от контроля) (рис. 1 а, б; 2). У 1-кратно ПК-крыс в ответ на ТГГ происходили схожие изменения (см. рис. 2). В отличие от этого 3-и 6-кратное ПК предотвращало потерю нейронов в полях СА1 и СА4 вслед за ТГГ (см. рис. 1, в; 2). ТГГ вызывала отчетливо выраженные структурные повреждения нейронов гиппокампа, что проявлялось появлением значительного количества гиперхромных пикнотизированных клеток, перицеллюлярным отеком. Наряду с этим, во многих нейронах наблюдались глобальный хроматолиз, вакуолизация цитоплазмы, разрушение ядра и ядрышка (рис. 3, а, б). При 1-кратном ПК вслед за ТГГ обнаруживалась схожая картина структурных повреждений нейронов в полях СА1 и СА4 (см. рис. 3, в). В отличие от этого, у 3-кратно ПК-крыс после ТГГ строение нейронов было близко к таковому у контрольных животных (см. рис. 3, г). В то же время, у 6-кратно ПК-крыс вслед за ТГГ в большинстве нейронов полей СА1 и СА4 выявлялся умеренный хроматолиз, проявлявшийся разрушением больших глыбок хроматофильного вещества (рибонуклеопротеиновых гранул), его распылением в цитоплазме, декомпозицией ядрышка (см. рис. 3, д). Обсуждение полученных данных. В проведенном исследовании установлено, что к 7-м суткам вслед за ТГГ происходят существенные повреждения структур нейронов дорсального (СА1) и вентрального отделов (СА4) гиппокампа. Ранее нами [8] были выявлены отчетливо выраженные морфологические изменения нейронов этих областей к 3-м суткам после ТГГ, которые в более отдаленный период (7 сут) значительно усиливаются, вплоть до гибели 30-40% клеток. Во многих оставшихся нейронах отмечаются признаки апоптотического и некротического повреждения. При различных по кратности режимах ПК, предшествующих ТГГ, выявлена специфика их действия, направленного на предотвращение этих повреждений. Один сеанс ПК оказывается неэффективным в этом отношении. 6-, и особенно, 3-кратные сеансы ПК индуцируют протективные механизмы предотвращения повреждений нейронов. Ранее было показано, что ТГГ индуцирует в гиппокампе экспрессию проапоптотических факторов Bax, c-Jun, JNK, а 3-кратное ПК вызывает их подавление и усиление экспрессии антиапоптотических факторов Bcl-2, Bcl-xL, ERK-MAP [4, 6, 14]. Большой интерес представляют выявленные различия эффектов 3-и 6-кратного ПК на структуру нейронов гиппокампа через 7 сут после ТГГ. При этом морфологическая картина при 3-кратном ПК близка к контролю. В то же время, в большинстве нейронов как СА1, так и СА4-полей гиппокампа у 6-кратно ПК-крыс отмечается умеренный хроматолиз. Этот процесс, очевидно, связан с функциональной нейрональной перегрузкой в результате чрезмерного количества ПК-воздействий, предшествующих ТГГ, что, вероятно, может приводить к пролонгированной гиперметаболической активности клеток. По всей видимости, это явление может иметь негативные функциональные последствия. Как ранее было показано, при использовании теста водного лабиринта Мориса - экспериментальной модели изучения обучения и памяти, ТГГ вызывала нарушение памяти у крыс, а 3-кратное ПК практически полностью предотвращало это расстройство [1, 2]. Очевидно, это может быть обусловлено повышенным метаболизмом нейронов, связанным с умеренным хроматолизом. В многочисленных работах середины прошлого столетия было установлено, что умеренный хроматолиз связан с обеднением нервных клеток мозга рибонуклеопротеидами при их повышенной функциональной активности [3]. При длительной функциональной нагрузке, обусловленной продолжительной стимуляцией нейронов различными факторами, в том числе, очевидно, и чрезмерным количеством эпизодов гипоксического ПК, может развиваться так называемая «хромофобия утомления», которая приводит к функциональным расстройствам. Полученные нами данные следует учитывать при выборе наиболее эффективного нейропротективного режима ПК, каковым, в частности, является 3-кратное ПК-воздействие умеренной гипобарической гипоксии. Механизмы нейропротекции повреждений, вызываемых тяжелыми формами гипоксии/ишемии, интенсивно изучаются в последнее десятилетие [4, 11, 19]. Установлено, что важная роль в предотвращении структурных и функциональных повреждений клеток мозга при этом принадлежит активации проадаптивных генов и белков. Было продемонстрировано, что 3-кратное гипоксическое ПК вызывает в нейронах гиппокампа и неокортекса оверэкспрессию проадаптивных ранних генов и их продуктов - транскрипционных факторов (NGFI-A, c-Fos, pCREB, NF-kB, GR, MR, Hif-1б), контролирующих процессы нейропластичности и выживания/ гибели нервных клеток [4]. Важно отметить, что их экспрессия усиливалась как до, так и после ТГГ. Вместе с тем, обнаружено, что в отличие от этого, 1-кратное ПК не способно повышать экспрессию этих транскрипционных факторов, а также продуктов их генов-мишеней - нейропротективных белков BDNF и Bcl-2 [4, 7, 9, 13, 16]. В последние годы выдвинуто положение о важной роли эпигенетических механизмов, регулирующих экспрессию генов, в реакциях нейронов мозга на гипоксию/ишемию [12, 17, 20]. Эпигенетические модификации гистонов (ацетилирование, метилирование) вызывают активацию или репрессию транскрипции, в том числе и укаков, участвующих в повышении резистентности мозга к тяжелым формам гипоксии/ишемии. Таким образом, проведенное исследование выявило различия влияния разных режимов (1-, 3-и 6-кратных сеансов) ПК умеренной гипобарической гипоксии на строение нейронов полей СА1, СА4 гиппокампа у крыс в отдаленный период (7 сут) после тяжелой гипоксии. 1-кратное ПК не оказывало протективного действия на структурные повреждения нейронов, вызываемые ТГГ, тогда как многократные (3 и 6 сеансов) ПК-воздействия предотвращали их проявление. Однако при 6-кратном ПК, в отличие от 3-кратного, в нейронах дорсального (СА1) и вентрального (СА4) отделов гиппокампа выявлялся умеренный хроматолиз, свидетельствующий, очевидно, о клеточной пролонгированной гиперметаболической активности, связанной с функциональной перегрузкой, обусловленной большим количеством ПК-воздействий. Это может негативно отражаться на процессах обучения и памяти после ТГГ. Полученные данные следует учитывать при разработке эффективных немедикаментозных способов протекции клеток мозга при повреждающих воздействиях.

About the authors

M. O. Samoilov

I. P.Pavlov Institute of Physiology

Email: samoilov@pavlov.infran.ru
Laboratory of Brain Neuron Function Regulation

A. V. Churilova

I. P.Pavlov Institute of Physiology

Email: annch05@mail.ru
Laboratory of Brain Neuron Function Regulation

T. S. Glushchenko

I. P.Pavlov Institute of Physiology

Email: tsgluschenko@mail.ru
Laboratory of Brain Neuron Function Regulation

References

Supplementary files