CHANGES OF THE CEREBRAL CORTEX AFTER DOSED TRAUMATIC BRAIN INJURY IN RATS OF DIFFERENT AGES

Full Text

Черепно-мозговая травма (ЧМТ) является широко распространённой медицинской и социальной проблемой в современном мире [13]. В зависимости от биомеханизма ЧМТ повреждения могут возникать как в участках мозга, непосредственно прилежащих к месту приложения силы, так и в отдалённых областях - зонах противоудара, локализующихся чаще всего в пределах коры лобных и височных долей или у основания мозга [7]. Для изучения последствий повреждения мозга при ЧМТ используются различные виды моделей на животных [12]. Наиболее распространённой является модель латерального гидродинамического удара (жидкостно-перкуссионной травмы мозга). Для этой модели характерна высокая воспроизводимость результатов и возможность широко варьировать силу удара, вызывая повреждения мозга различной степени тяжести [10]. Основными первичными последствиями травмы при латеральном гидродинамическом ударе являются формирование геморрагий, острая гибель нейронов, повреждение гематоэнцефалиизменениями считают комплекс биомеханических, структурных и молекулярных изменений, происходящих в результате первичного повреждения. К таковым относятся: воспаление, эксайтотоксичность и нейродегенерация. Репаративные процессы включают в себя нейро-, глио-и ангиогенез [9, 15]. Травмы в пожилом возрасте характеризуются длительным периодом восстановления и худшим прогнозом по сравнению с травмой в более раннем возрасте [14]. Это может быть связано с усиленным нейровоспалением и повышенной проницаемостью сосудов [11]. Цель настоящего исследования - характеристика нейронов и глии и сравнение гистологических нарушений в мозгу у крыс разного возраста после дозированной ЧМТ. Материал и методы. Работавыполненанасамцахкрыс линии Вистар (питомник «Столбовая»). Экспериментальные манипуляции одобрены этическим комитетом ИВНД и НФ РАН (протокол № 10 от 10.12.2012 г.) и проводились в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Крысы были разделены на 2 группы: 1-я группа состояла из 13 животных в возрасте 12 мес; 2-я группа - из 9 животных в возрасте 24 мес. Масса крыс 1-й группы - 355-467 г, 2-й группы - 430-627 г. Для моделирования ЧМТ была использована широко применяемая методика гидродинамического удара [4]. У 8 крыс 1-й группы была смоделирована ЧМТ при различной силе удара: 3 крысы (2-2,27 атм., средняя) и 5 крыс (3-3,37 атм., тяжёлая). Гидродинамический удар проводили через 2-3 ч после трепанации и выхода крыс из наркоза. В качестве контроля были использованы 3 интактные и 2 ложнооперированные крысы; для последних процедура отличалась только исключением гидродинамического удара. У крыс 2-й группы была смоделирована тяжёлая ЧМТ при силе удара 3-3,37 атм. (5 крыс). Травму наносили через 1 сут после трепанационной краниотомии. В качестве контроля использованы 2 ложнооперированные и 2 интактные крысы. Трепанацию черепа проводили под хлоралгидратным наркозом (395 мг/кг, внутрибрюшинно [8]). Диаметр отверстия в правой теменной кости составлял 3 мм. Отверстие располагалось на 3 мм каудальнее брегмы и на 3 мм латеральнее срединной линии. Через 7 сут после гидродинамического удара для гистологического и иммуногистохимического анализа мозг фиксировали путем интракардиальной перфузии 4% раствора параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4). Выбранный срок обусловлен минимальным временем формирования отчетливо выраженного астроцитоглиального рубца (1-4 нед [4, 5]). Фронтальные вибротомные срезы толщиной 50 мкм брали из области, ограниченной фронтальными плоскостями, проведёнными через точки с координатами 1 и 5 мм каудальнее брегмы. Для анализа использовали 2 последовательных среза с интервалом между парой срезов в 600 мкм (12 срезов у каждой крысы, по 6 для каждого вида окрашивания). Половину полученных срезов окрашивали крезиловым фиолетовым по методу Ниссля. Оценку степени повреждения коры мозга проводили с использованием микроскопа Leica DM6000 B (Leica Microsystems, ФРГ) (таблица). Маркером астроглиоцитов являлся глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) промежуточных филаментов, разведение антител 1:500 (DAKO, Дания). Проявление окрашивания проводили с использованием 3,3́-диаминобензидина. Оценку площади повреждения осуществляли, используя микрофотографии срезов, при помощи программы ImageJ. Выделение очагов глиоза проводили вручную с расчётом среднего значения по результатам трёх измерений на каждом срезе каждого очага в коре большого мозга ипсилатерального полушария. Для выявления зависимостей использовали регрессионный анализ. Результаты исследования. 1-я группа. При анализе последствий ЧМТ на срезах мозга в коре полушария, ипсилатерального травме, были выявлены зоны прямого и отдалённого повреждения (рис. 1). Зона прямого повреждения соответствовала области непосредственного контакта столба жидкости с твёрдой мозговой оболочкой, тогда как зона отдалённого повреждения располагалась в удалении от первой и отделялась от неё неизменённой нервной тканью. Астроцитарный глиоз в зоне прямого повреждения на срезах мозга выявлялся у 6 из 8 животных при реакции на GFAP (см. рис. 1, б) и отсутствовал у ложнооперированных и контрольных животных. Глиоз был наиболее выражен в I-IV слоях коры на срезах, взятых из области, каудальнее брегмы на 3 мм (первичная соматосенсорная кора, первичная моторная кора). В данной области отсутствовали изменения нейронов при окрашивании срезов по методу Ниссля. Зона прямого повреждения соответствовала форме трепанационного отверстия с центром в точке, каудальнее брегмы на 3 мм. Наблюдалась тенденция к уменьшению площади как ростральнее, так и каудальнее этой точки: F (df1=2, df2=30)=6,277, P=0,005 (рис. 2, а). В зоне отдалённого повреждения астроцитарный глиоз выявлялся при реакции срезов мозга на GFAP у 8 из 8 животных (см. рис. 1, г). Зона расположена в I-VI слоях латеральных отделов коры (первичная соматосенсорная зона, слуховая кора, зрительная кора, некоторые ассоциативные зоны) и имеет схожую форму с очагом прямого повреждения [F (df1=2, df2=42)=3,189, P=0,051], но с тенденцией к более каудальному расположению центра зоны повреждения (см. рис. 2, б). На срезах мозга у 3 из 6 животных между зонами имелся слой ткани с неизменённой астроцитарной глией; у 3 из 6 животных зоны глиоза были визуально различимы, но соединены полосой глиоза в I-III слоях коры. Таким образом, зона отдалённого повреждения была расположена вентральнее, латеральнее и каудальнее зоны прямого повреждения. Местоположение зоны отдалённого повреждения совпадало у всех животных с ЧМТ (см. рис. 1, е). На срезах мозга у 8 животных не было выявлено отчетливой зависимости площади глиоза отдельно в каждой зоне или суммарно в обеих зонах от силы удара. Морфологические изменения в коре большого мозга после ЧМТ, выявленные при окраске по методу Ниссля, показаны на рис. 3. Для определения зависимости морфологических изменений в зоне отдаленного повреждения коры от силы 2-я группа. Для всех крыс этой группы, вклюудара при моделировании ЧМТ использовали по чая контрольных, характерны негрубые изменеодному срезу от каждой крысы на уровне 3,5 мм ния, проявляющиеся наличием областей с ишекаудальнее брегмы (рис. 4). мически изменёнными нейронами (вытянутой треугольной формы с тёмными цитоплазмой и ядром, извитым апикальным дендритом), вероятно, располагающимся по ходу сосудов, общего увеличения иммунореактивности коры при реакции на GFAP с диффузно расположенными плохо прокрашивающимися очагами (зонами «просветления»), а также отложения зёрен липофусцина во внеклеточном пространстве. Последствия тяжёлой ЧМТ у крыс 2-й группы значительно отличались по гистологическим изменениям от таковых у животных 1-й группы. Зоны прямого и отдалённого повреждения у крыс 2-й группы имели другую структуру астроцитарного глиоза: клетки были расположены редко, с зонами «просветления», отсутствовала астроглия вдоль крупных сосудов. Кроме того, были выявлены значительные диффузные повреждения в коре обоих полушарий (рис. 5, г, з-к). В зоне прямого повреждения мозга у всех животных присутствовал отчетливо выраженный поверхностный глиоз с очагами «просветления», в которых астроглия отсутствовала (см. рис. 5, а, в, д). Незначительно выраженная активация астроглии в этой зоне наблюдалась у ложнооперированных крыс и отсутствовала у контрольных животных. Выявлялось увеличенное число ишемически измененных нейронов. Зона прямого повреждения у крыс 2-й группы имела в целом те же пространственные характеристики, что и зона прямого повреждения у крыс 1-й группы. Повреждения в отдалённой зоне были обнаружены у 4 из 5 животных с ЧМТ и отсутствовали у контрольных крыс. В этой зоне имелись очаги ишемии, число глиальных клеток было незначительно увеличено (повреждение в 1-2 балла). Наблюдался неравномерный глиоз с зонами «просветления» (см. рис. 5, а, б, д). Отсутствовала зона некроза, характерная для тяжёлой ЧМТ у крыс 1-й группы. Диффузное повреждение мозга (многочисленные ишемически измененные нейроны, отсутствие астроглии по ходу сосудов) было выражено в обоих полушариях у всех крыс с ЧМТ. Подобные грубые изменения отсутствовали у контрольных животных (см. рис. 5, е, ж). Обсуждение полученных данных. Изучение гистологических изменений в мозгу после дозированной ЧМТ показало, что последствием гидродинамического удара является возникновение двух зон повреждений в ипсилатеральном полушарии. Вероятно, формирование неодинаковых по локализации и морфологическим изменениям зон связано с различными биомеханизмами травмы. Происхождение первой зоны непосредственно под трепанационным отверстием связано, очевидно, с определённым видом деформации - компрессией ткани мозга под действием гидродинамического удара. Этот очаг фактически повторяет форму трепанационного отверстия, причём область наибольших повреждений располагается под центром отверстия, что, скорее всего, соответствует зоне наибольшей компрессии. Во второй зоне, вероятно, происходит другой вид деформации - смещение слоёв ткани мозга относительно друг друга. Этим объясняется локализация очага - области наибольшего повреждения располагаются каудальнее и латеральнее зоны прямого повреждения, т. е. на границе неизмененной и «компрессированной» нервной ткани. Именно в области отдалённого повреждения наблюдаются отчетливо выраженные кровоизлияния [4]. Описанные изменения сопровождаются отеком и в дальнейшем образованием очагов коагуляционного некроза [3], что было ранее показано при использовании модели гидравлического удара [15]. Известно, что геморрагический инсульт является одной из основных причин судорожных приступов у людей пожилого возраста [1]. Как первый, так и второй очаги могут привести к образованию источников судорожных разрядов в течение первых 10 сут после ЧМТ с дальнейшей трансформацией в эпилепсию [6]. В эксперименте были использованы крысы двух возрастных групп. В мозгу у контрольных крыс в возрасте 24 мес обнаружены умеренный глиоз с плохо прокрашивающимися очагами, некоторое количество ишемически измененных нейронов. Гистологические последствия ЧМТ у крыс этой группы были более диффузны, чем у крыс в возрасте 12 мес, что может быть связано со сниженной реактивностью, а также «наложением» на сопутствующую возрастную патологию мозга. Повреждения в мозгу у контрольных и сопутствующая патология у экспериментальных крыс в возрасте 24 мес могут зависеть от возрастных нарушений микроциркуляции. У контрольных животных в возрасте 12 мес подобных нарушений в мозгу не обнаружено - последствия дозированной ЧМТ имеют локальный характер. Вероятно, сосудистое русло мозга у крыс линии Вистар крайне ранимо и обладает местной неустойчивостью к внешним воздействиям. Из линии Вистар была выведена линия крыс Крушинского-Молодкиной с генетической формой аудиогенных судорог. У крыс этой линии на сильные звуки развивается судорожный припадок, а при морфологическом исследовании обнаруживаются множественные внутримозговые кровоизлияния. Показано, что 10-15% крыс линии Вистар обладают латентной аудиогенностью [2]. Это ограничивает их использование в длительных хронических экспериментах, не предусматривающих специальную задачу исследования судорожной активности. Воспроизводимость и адекватность модели позволяет использовать её для исследования молекулярно-генетических механизмов последствий ЧМТ у человека, а также выявления общих механизмов последствий ЧМТ и патогенеза важнейших заболеваний, коморбидных с ЧМТ, в первую очередь депрессии и эпилепсии. Итак, независимо от возраста животных гидродинамический удар у крыс вызывает формирование двух очагов повреждения в коре ипсилатерального полушария большого мозга. Повреждение зависит от силы удара и характеризуется изменениями строения нейронов и формированием однородного астроглиального рубца. У крыс в возрасте 24 мес преобладает диффузное повреждение с наличием ишемически измененных нейронов по ходу сосудов, с формированием неоднородного астроглиального рубца с диффузно расположенными плохо прокрашивающимися очагами и слабой реакцией нейронов, что не характерно для животных в возрасте 12 мес.

About the authors

I. G. Komol’tsev

RAS Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology

Email: outaudiofillin@gmail.com
Laboratory of Functional Biochemistry of the Nervous System

I. P. Lyovshina

RAS Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology

Email: ilevshina@yandex.ru
Laboratory of Functional Biochemistry of the Nervous System

M. R. Novikova

RAS Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology

Email: mrnovikova.ihna@mail.ru
Laboratory of Functional Biochemistry of the Nervous System

M. Yu. Stepanichev

RAS Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology

Email: m_step@pochta.ru
Laboratory of Functional Biochemistry of the Nervous System

A. O. Tishkina

RAS Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology

Laboratory of Functional Biochemistry of the Nervous System

N. V. Gulyayeva

RAS Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology

Email: nata_gul@pisem.net
Laboratory of Functional Biochemistry of the Nervous System

References

Supplementary files