THE EFFECT OF PERINATAL HYPOXIA ON THE STRUCTURE OF BLOOD-BRAIN BARRIER IN RATS TREATED WITH SALIFEN

Full Text

В клинических и экспериментальных исследованиях последних лет все большее внимание уделяется изучению механизмов гипоксическиишемических поражений головного мозга у новорожденных. Перинатальная гипоксия является одной из ведущих причин младенческой смертности и инвалидности [3]. Перинатальные поражения нервной системы у детей ведут к инвалидизации почти в 40% случаев: по мере взросления у них могут развиться детский церебральный паралич, симптоматическая эпилепсия, задержка умственного развития, нарушения в когнитивной и эмоциональной сферах [1]. Эта медицинская и социальная проблема определяет актуальность проведения фундаментальных и клинических исследований, направленных на поиск и разработку новых нейропротективных средств. Активно проводящиеся в данном направлении работы базируются на данных о механизмах и мишенях гипоксических воздействий в головном мозгу [3, 8, 9, 11, 12]. При изучении влияний воздействия гипоксии в ранний постнатальный период были обнаружены нарушения структур и функций головного мозга [4-6]. Сопоставление полученных морфологических и физиологических фактов с данными клиницистов позволили полагать, что наши эксперименты моделируют одну из форм энцефалопатии у новорожденных [4]. Эта отработанная в лаборатории модель пригодна для изучения нейропротективных эффектов разных препаратов. После консультаций с фармакологами Волгоградского медицинского университета, специализирующихся на разработке и изучении нейропротекторов, было решено вначале использовать отечественный препарат «Салифен», который представляет собой композицию фенибута с салициловой кислотой и оказывает нейро-, гравидо- [2] и эндотелиопротекторное действие, очевидно обусловленное его ГАМК-А-и ГАМК-Б-миметическим свойством [10]. Этот препарат обладает также антигипоксическими, антиоксидантными, антиагрегантными, антикоагулянтными, антистрессорными свойствами, что позволило предположить, что он может оказаться эффективным нейропротектором при моделировании энцефалопатий у новорожденных, вызванных воздействием гипоксии в ранний постнатальный период. Цель настоящей работы - изучение структурных характеристик элементов гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) головного мозга животных после перинатальной гипоксии и введения салифена. Материал и методы. Воздействие гипоксии на головной мозг крысят осуществляли на 2-е сутки постнатального развития в барокамере в течение 1 ч при содержании в дыхательной смеси: кислорода - 7,6-7,8%; углекислого газа - 0,15-0,21%; азота - 91,8%, при температуре - 21,3-23 ºСи нормальном общем давлении. В работе были использованы 3 группы животных: 1-я - экспериментальная группа - крысята, подвергавшиеся воздействию гипоксии и получавшие салифен через 1 сут после ее воздействия (в течение 14 сут, в дозе 15 мг/кг); 2-я - контрольная группа - животные, подвергавшиеся воздействию только гипоксии и 3-я - контрольная группа - интактные животные того же возраста. Каждая группа содержала по 8-10 крысят. Материал исследовали на 20-е сутки после рождения. Все процедуры проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Для проведения гистологических исследований мозг крысят фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде на фосфатносолевом буфере (рH 7,4) в течение 24 ч, обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой методике, готовили серийные фронтальные срезы толщиной 5-7 мкм, окрашивали метиленовым синим (Sigma, США) по методу Ниссля и заключали в синтетическую среду Permaunt (Thermo, США). Исследования проводили под световым микроскопом Leica DME (Leica, Германия). Изображения получали при помощи цифровой видеокамеры Leica EC3 (Leica, Германия). Для компьютерной морфометрии использовали изображения, полученные с гистологических поперечных срезов конечного мозга на уровне Bregma -1,80- -2,04 мм, на которых определяли площадь поперечных сечений капилляров. Измерения проводили на 10 серийных срезах мозга, взятого у 4 животных каждой исследованной группы. Статистическую обработку полученных показателей осуществляли при помощи пакета прикладных компьютерных программ Statistica 6.0, ImageScope Color и ORIGIN50. Значимость различий определяли по величине t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при Р<0,001. Для электронно-микроскопического исследования фрагменты неокортекса (сенсомоторной области) обрабатывали по общепринятым схемам глутаросмиевой фиксации на соответствующих буферах, заливали в аралдит. Ультратонкие срезы после контрастирования уранилацетатом и ацетатом свинца просматривали в микроскопе Tecnai G2 Spirit (FEI, Германия) при ускоряющем напряжении 70 кВ. Результаты исследования. Исследование, проведенное на светооптическом уровне, показало, что салифен оказывает положительное влияние на сосуды микроциркуляторного русла в неокортексе крыс. На 20-е сутки постнатального развития у интактных крыс, а также у подвергавшихся перинатальной гипоксии, и у животных, получавших салифен, площадь поперечных срезов капилляров составила 28670±64, 19981±48 и 27860±59 мм² соответственно. Различия значений средних размеров капилляров у контрольных крыс и у получавших салифен оказались незначимыми в отличие от таковых у крыс, подвергавшихся перинатальной гипоксии. Электронно-микроскопически были изучены структурные компоненты ГЭБ: эндотелиоциты капилляров и их специализированные контакты, базальная мембрана, перициты вместе с окружающими астроцитами и их отростками. У интактных животных во всех слоях неокортекса присутствовали капилляры на разных стадиях формирования и крупные сосуды. Ядра эндотелиоцитов капилляров были крупные, лопастеобразные и имели высокую электронную плотность, площадь цитоплазмы - невелика. В ней обнаруживались немногочисленные органеллы, преимущественно полисомы, единичные канальцы гладкой эндоплазматической сети и микропиноцитозные пузырьки (рисунок, а). Число специализированных контактов между эндотелиоцитами было небольшим. В просвете части сосудов можно было видеть отростки эндотелиоцитов. Базальная мембрана имела ровные контуры, но ее дифференцировка была неодинакова по всей окружности сосуда, встречались участки, практически не включающие в себя волокнистый внеклеточный материал, и изредка местами можно было наблюдать самые начальные этапы сгущения этих волокон. Перициты часто оказывались включенными в стенку капилляра. Снаружи базальной мембраны присутствовали отечные конечные ножки периваскулярных астроцитов. У крыс после воздействия гипоксии размеры ядер и цитоплазмы эндотелиоцитов капилляров были больше, чем у интактных животных, что в ряде случаев приводило к сужению их просвета (см. рисунок, б). В цитоплазме наблюдались небольшое число органелл и слабо развитая эндоплазматическая сеть с немногочисленными канальцами, протяженность и ширина которых были значительно меньше, чем у интактных крыс. К мембранам эндоплазматической сети, как правило, были прикреплены только единичные рибосомы. В цитоплазме определялись свободные полисомы, но плотность их расположения была значительно ниже, чем у интактных крыс. Кроме этого, появились электронно-плотные гранулы, порой образующие скопления, и единичные тельца Вейбеля-Паладе. В цитоплазме эндотелиоцитов было больше микропиноцитозных пузырьков и вакуолей, чем у интактных животных и у крыс после гипоксии без введения салифена, что свидетельствует об усилении транспортных процессов через цитоплазму эндотелиоцитов. Электронная плотность базальной мембраны повышена. В нейропиле вокруг капилляров появились отечные отростки астроцитов, встречались дегенерирующие перициты. У крыс после введения терапевтической дозы салифена не наблюдалось увеличения размеров эндотелиоцитов, отсутствовало сужение их просвета (см. рисунок, в), базальная мембрана состояла из внеклеточного материала, который, однако, не формировал плотный слой. Периваскулярный отек сохранялся, при этом дифференцировка протоплазматических астроцитов была выше, чем во 2-й контрольной группе - у животных после гипоксии. Обсуждение полученных данных. Полученные результаты свидетельствуют о том, что салифен обнаруживает протективное действие на структуры ГЭБ у крысят, подвергшихся гипоксии. Воздействие терапевтической дозы салифена в течение 14 сут (т. е. всего периода новорожденности, вплоть до начала ювенильного периода) после воздействия острой перинатальной нормобарической гипоксии оказывает положительное действие на состояние компонентов сосудистой стенки. Сравнение этих результатов с данными, полученными нами в аналогичных экспериментах без использования салифена [5], позволяет предполагать стабилизирующее воздействие препарата на активно идущие в это время процессы ангиогенеза. При этом отмечена реакция ведущего звена ГЭБ - эндотелиоцитов. Под влиянием салифена постгипоксические их реакции смягчаются, что подтверждает данные фармакологов о том, что одной из мишеней данного протектора являются эндотелиоциты. По мнению исследователей [2, 7], это вызывает снижение вазодилататорной функции сосудов микроциркуляторного русла, что может быть фактором, способствующим адаптации микроциркуляторного русла и регуляции проницаемости ГЭБ в новых условиях функционирования. Проведенная нами работа свидетельствует об активном влиянии салифена на компенсаторноприспособительные реакции ГЭБ в ответ на воздействие гипоксии и перспективности дальнейших исследований его протективных свойств. Авторы глубоко признательны директору Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН акад. Н. П. Веселкину и ст. науч. сотр. Е. Селиверстовой за предоставленную возможность работы на современном электронном микроскопе.

About the authors

V. A. Otellin

I. P.Pavlov Institute of Physiology

Email: v.otellin@mail.ru
Laboratory of the Nervous System Ontogenesis

L. I. Khozhai

I. P.Pavlov Institute of Physiology

Email: astarta0505@mail.ru
Laboratory of the Nervous System Ontogenesis

I. N. Tyurenkov

Volgograd State Medical University

Email: fibfuv@mail.ru
Department of Pharmacology

References

Supplementary files