PLASTIC REORGANIZATION OF THE ULTRASTRUCTURE OF SYNAPSES IN THE CEREBELLUM DUE TO TOXIC EFFECTS OF GLUTAMATE AND NO-GENERATING COMPOUND

Full Text

При воздействии на организм внешних и внутренних факторов, существенно превышающих физиологическую норму, происходят нарушения структуры и функции клеток, как это имеет место при ишемических и геморрагических инсультах [1, 5, 7]. Как известно, мозжечок (МЖ) осуществляет важную функцию регуляции движений, обеспечивая при этом равновесие и контроль положения тела. Влияя на неокортекс, он участвует в различных формах пластичности и когнитивных процессах. Основным возбуждающим медиатором в МЖ является глутамат (Glu). Согласно современным представлениям, основной причиной поражения нервных клеток при ишемии, гипоксии, травме мозга и ряде других распространенных неврологических заболеваний, сопровождающихся структурными перестройками, является гиперактивация рецепторов Glu, стойкое повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция (Са2+) и оксида азота (NO) [1, 5, 11]. Длительная активация рецепторов Glu его токсическими дозами может приводить к некротическим и апоптотическим изменениям нейронов. Этот процесс получил название эксайтотоксического действия Glu [1, 4, 7]. Под нейропластичностью понимают способность мозга, нейронов или глии осуществлять компенсаторные структурно-функциональные перестройки под воздействием каких-либо факторов и сохранять их после его окончания [3, 12]. На клеточном и субклеточном уровнях рассматривают ультраструктурные изменения, связанные с белками, липидами и нуклеиновыми кислотами [1, 2, 10, 12-15]. Изучение нейропластичности, ее резервов в условиях ишемии/гипоксии, инсульта, а также компенсаторно-приспособительных реакций, имеет не только теоретическое, но и практическое значение. Цель данной работы - исследование пластических перестроек на уровне синапсов параллельных волокон (ПВ) МЖ и дендритов клеток Пуркинье (ДПК), которые могут быть способом защиты при токсическом воздействии Glu и NO (модель инсульта). Материал и методы. Объектом исследования служил изолированный МЖ лягушки (Rana temporaria). При этом были созданы условия, характерные для инсульта путем повышения концентрации таких веществ, как Glu и NO. Glu, как основной нейромедиатор, осуществляет взаимодействие в синаптическом контакте ПВ-ДКП. Использован МЖ 23 взрослых лягушек. Исследования проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 775 от 12.08. 1977 г. МЗ СССР). Были выполнены 7 экспериментальных вариантов: 1-й вариант - фиксация головного мозга сразу же после извлечения из черепной коробки, с последующей изоляцией МЖ (норма); 2-й вариант - инкубация 2 чв чистом растворе Рингера (РР) - контроль инкубации; 3-й вариант - инкубация в РР с Glu (1 мМ, 2 ч); 4-й вариант - инкубация в РР с NO (1 мМ, 2 ч); 5-й вариант - стимуляция ПВ (1 ч, 0,1 Гц) в чистом РР, затем инкубация (1 ч) в том же растворе; 6-й вариант - стимуляция ПВ (1 ч, 0,1 Гц) в РРс 1 мМ Glu, затем инкубация в той же среде (1 ч); 7-й вариант - стимуляция ПВ (1 ч, 0,1 Гц) в РР с NO (1 мМ, 1 ч), затем инкубация в той же среде (1 ч). Стимуляцию проводили одиночными прямоугольными импульсами электрического тока нихромовыми биполярными электродами, запаянными в стекло (диаметр нихромовой проволоки 40 мкм), расположенными на поверхности молекулярного слоя МЖ, частота стимуляции 0,1 Гц, длительность импульсов 100 мкс, сила тока 104-105 А. Состав оксигенированного рас + твора Рингера: 115 мМ Na+, 2,5 мМ К+, 1,2 мМ Сa2 , 6,0 мМ NaHCO3, 2 г глюкозы на 1 л раствора, рН 7,2-7,4. NaNO2 использовали как вещество, способное превращаться в NO в результате восстановления ионов NO2 [6, 14]. Препараты для электронно-микроскопических исследований готовили по стандартной методике: фиксацию осуществляли 2,5% раствором глутаральдегида, приготовленном на 0,1 М Na-какодилатном буфере (рН 7,2), содержащем 0,5% танниновой кислоты и 3% сахарозы (1,5 ч при 4 °C). Далее материал фиксировали в 1% OsO4 (рН 7,2) в том же буфере в течение 1 ч при 4 °C. Материал обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации и ацетоне, заключали в смесь эпона-аралдита. Срезы контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца и исследовали с помощью электронного микроскопа JEM 100 SX (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 90 кВ. Во всех 7 экспериментальных вариантах на электронномикроскопических снимках, сделанных при одинаковых увеличении (8000) и величине кадра - 8×12 см в каждом кадре в 10 разных полях зрения подсчитывали количество синапсов, бутонов и шипиков. В каждом экспериментальном варианте определяли относительное содержание (%) синапсов различной конфигурации. Оценку статистической значимости полученных данных проводили по t-критерию Стьюдента. Результаты исследования. При воздействии избытка Glu (1 мМ) или NO-генерирующего соединения (NaNO2, 1 мМ) на МЖ лягушки происходит изменение конфигурации исследованных синапсов (рис. 1, а-д). Так, под влиянием Glu преобладает обхватывание бутонов шипиками, а под влиянием NO - шипиков бутонами. Наблюдалось большое разнообразие формы синапсов при воздействии одного и того же нейромедиатора (Glu). Например, бутон почти наполовину мог быть обхвачен дендритным шипиком, при этом в бутоне сохранялись синаптические пузырьки, с открытой стороны он был окружен глиальной клеткой (см. рис. 1, б). В других случаях при значительном обхвате бутона шипиком между ними полностью (см. рис. 1, в) или частично (см. рис. 1, г) сохранялось постсинаптическое уплотнение - ПУ (post synaptic density). Встречались синапсы, где бутон был обхвачен шипиком, а весь синапс, в свою очередь, со всех сторон окружен глиальными клетками (см. рис. 1, д). Еще одна глиальная клетка могла быть связана с шипиком так называемым мостиковым контактом. Если в присутствии избытка Glu происходило увеличение объема шипиков, то в среде с избытком NO-генерирующего соединения значительно увеличился объем бутонов и наблюдался обхват шипика бутоном подобно шляпке гриба (рис. 2, а, б). В обоих случаях в шипике следует отметить присутствие микротрубочек, а также значительное разрушение синаптических пузырьков. При менее значительном обхвате шипика бутоном шипик мог быть покрыт спиралевидной структурой - глиальной «обкруткой» (см. рис. 2, в). Встречались сильно поврежденные синапсы (см. рис. 2, г), шипик полностью был окружен «обкруткой», образованной глиальной клеткой. Морфометрическое исследование и статистический анализ данных подтвердили, что в растворе Glu преобладают синапсы, в которых наблюдается обхват терминальных бутонов дендритными шипиками (таблица, Ш-Б-синапсы), а в среде с NO-генерирующим соединением - шипиков бутонами (см. таблицу, Б-Ш-синапсы). В норме приблизительно 70% синапсов более чем наполовину окружены глиальными клетками (см. таблицу, Г-С-синапсы). При инкубации МЖ в РР доля таких синапсов значимо не уменьшается по сравнению с нормой (см. таблицу). Значимое снижение доли таких синапсов по сравнению с нормой происходит при инкубации с Glu и NO (см. таблицу, опыты 3 и 4). Стимуляция возвращает долю Г-С-синапсов к норме. При инкубации МЖ в РР значимо снижается доля синапсов, бутоны которых окружены глиальными клетками (см. таблицу, Г-Б-синапсы), но не снижается доля синапсов, у которых глиальными клетками окружены шипики (см. таблицу, Г-Ш-синапсы). Стимуляция значимо не повышает долю Г-Б-синапсов, относительное содержание Г-Ш-синапсов при этом значимо выше нормы (см. таблицу). Инкубация МЖ в присутствии Glu значимо снижает долю Г-С-синапсов по сравнению с нормой и не снижает при стимуляции в Glu (см. таблицу), при этом наблюдаются различия между относительным содержанием Г-Б-иГ-Шсинапсов. При инкубации в Glu доли Г-Б-иГ-Шсинапсов снижаются приблизительно в 2 раза, но относительное содержание Г-Ш-синапсов превышает таковое Г-Б-синапсов. Стимуляция в Glu увеличивает долю тех и других по сравнению с таковой при инкубации в Glu, однако по сравнению с нормой при инкубации в Glu доли Г-Б-иГ-Ш-синапсов были значимо ниже. Инкубация и стимуляция МЖ в присутствии NO-генерирующего соединения (см. таблицу, варианты 4 и 7) показали, что доля Г-Б-синапсов была значительно выше, чем Г-Ш-синапсов. При инкубации доля Г-Б-синапсов превышала долю Г-Ш-синапсов в 2 раза, а при стимуляции - в 10 раз. Таким образом, анализ нейрон-глиальных структур показал, что в растворе Glu преобладает окружение глиальными клетками шипиков, тогда как в присутствии NO-генерирующего соединения - бутонов. Отсюда следует, что разное функциональное состояние синапсов ПВ и ДКП в ответ на повреждающие воздействия избытка Glu и NO выражается в разной форме их синаптических контактов и нейрон-глиальных структур. Обсуждение полученных данных. Сравнительное исследование нейрон-нейронных о том, что при избытке Glu наблюдается увеличение объема шипиков, обхватывающих бутоны, ав среде с избытком NO-генерирующего соединения значительнее увеличивается объем бутонов, которые обхватывают шипики. Митохондрии представляют собой мишени для действия токсических концентраций Glu и NO [1, 4, 11]. Набухание шипиков и бутонов может происходить вследствие деэнергизации митохондрий и нарушения ионного гомеостаза, за счет снижения активности Са2+-и Na+-аденозинтрифосфатаз (АТФаз) в условиях дефицита АТФ и снижения мембранного потенциала. Активация входа ионов Na+ в клетку, как известно, сопровождается входом молекул Н2О и отёком клеток [11]. Таким образом, в ответ на действие повреждающих факторов - Glu и NO - синапсы ПВ-ДКП могут защищаться с помощью обволакивания бутона или шипика, а также при прямом участии глиальных клеток (нейрон-глиальное окружение). Сравнение нейрон-нейронных (синаптических) и нейрон-глиальных структур позволило объяснить, как в ответ на повреждающее воздействие Glu и NO-генерирующего соединения изменяется структура и развиваются компенсаторноприспособительные реакции [8-11]. В этом плане важно отметить сохранность ПУ в некоторых случаях, так как известно, что эта структура является местом локализации рецепторов Glu [13]. Кроме того, известно, что в структурной пластичности дендритных шипиков участвует механизм, основанный на динамике актиновых нитей, также примыкающих к ПУ [15]. Поэтому сохранность последних чрезвычайно важна для функционирования синапса, т. е. для дальнейшей передачи сигнала от зернистой клетки МЖ к ДКП. По-видимому, изменения, наблюдаемые нами в структуре синапсов, связаны с функционированием актиновой структуры шипика, действующей совместно с микротрубочками, в которых присутствует белок динеин, обладающий АТФазной активностью, присущей двум тяжелым цепям в его структуре. Естественно предположить, что актин шипиков, действуя совместно с динеином микротрубочек, локализованных в тех же шипиках (подобно актину и миозину мышц), осуществляет изменение структуры синапсов ПВ-ДКП лягушки в ответ на действие повышенной концентрации Glu и NO [12, 13, 15]. Возможно, пластические перестройки как синапсов, так и глиальных клеток лежат в основе функционирования нейронной сети МЖ в норме и при патологии [8, 9, 12, 13, 15]. Мы полагаем, что результаты настоящей работы могут иметь не только научное, но и практическое значение. Так, NO может вызывать не только значительные изменения (повреждения) нейронов при гиперстимуляции рецепторов Glu [4], но и играть роль фактора защиты, как это было показано при развитии геморрагического инсульта под влиянием акустического стресса у генетической линии крыс Крушинского-Молодкиной [2, 7]. Конкретный характер действия NO зависит от того, в какое время при развитии геморрагического инсульта происходит его активация или ингибирование. Таким образом, результаты настоящей работы, свидетельствуя о конкретных пластических перестройках в МЖ в условиях модельного инсульта, расширяют представления о защитных механизмах, уже обнаруженных в нейронах мозга виноградной улитки [3]. Можно ожидать, что они могут быть использованы при анализе клинических данных у больных с черепно-мозговой травмой и будут полезными для понимания механизма действия некоторых лекарственных препаратов (новых пептидных препаратов), таких как «Кортексин», которые уже применяются при повреждениях мозга [2].

About the authors

N. V. Samosudova

RAS A. A. Kharkevich Institute of Information Transmission Problems

Email: nsamos@iitp.ru
Laboratory for the Study of Information Processes at Cellular and Molecular Levels

V. P. Reutov

RAS Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology

Email: valentinreutov@mail.ru
Laboratory of Functional Neurocytology

References

Supplementary files