CHARACTERIZATION OF THE CELLULAR COMPOSITION OF THE MUCOSAL LAMINA PROPRIA OF THE JEJUNUM IN MICE SUBJECTED TO THE CONDITIONS SIMULATING LONG-DURATION SPACEFLIGHT

全文:

При проведении наземных экспериментальных исследований, воспроизводящих условия содержания и среду обитания при космических полетах на биоспутнике «Бион-М1» [1], было обнаружено, что многие физиологические показатели у животных претерпевают существенные изменения [2, 7, 9]. Более ранние исследования выявили, что пребывание животных в условиях космического полета приводит к изменениям практически всех систем, включая иммунную [4, 5]. Так как диффузные скопления лимфоидной ткани присутствуют в стенке пищеварительного тракта, то изучение изменений ее состава в связи с условиями полета и особенностями питания при микрогравитации представляет не только теоретический интерес, но весьма важно и для практической (космической) медицины. Поэтому цель данного исследования - изучение изменений клеточного состава собственной пластинки слизистой оболочки кишки под влиянием искусственно созданных на Земле условий космического полета (наземный эксперимент). Материал и методы. По программе полета биоспутника «Бион-М1» [1] исследовали 2 группы мышей-самцов С57/BL6 в возрасте 4-5 мес, свободных от патогенной микрофлоры. В 1-ю группу были включены 8 животных, которые в наземных условиях в течение 30 сут находились в блоках «БИОС-МЛЖ», установленных в климатических камерах, где воспроизводили условия содержания и среды обитания, существующие на биоспутнике (температура, влажность, газовый состав атмосферы) в период пребывания его в космосе (наземный эксперимент). Животные 2-й группы (6 мышей) были контрольными - их содержали в обычных условиях вивария. Мыши контрольной группы в свободном доступе получали стандартный сухой гранулированный корм, а животные экспериментальной - пастообразный корм, приготовленный из стандартного комбикорма, в состав которого были введены вода (76-78%) и казеин в качестве загустителя [6]. Эвтаназию животных осуществляли через 12 ч методом цервикальной дислокации (одобрена комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ - Института медико-биологических проблем РАН). Фрагменты начального отдела тощей кишки мышей фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином - эозином и для проведения цитологического анализа азуром II - эозином (БиоВитрум, Россия). Исследовали клеточный состав собственной пластинки слизистой оболочки кишки в центральной части ворсинок (СПВ) и между криптами (СПМК). Клетки лимфоидного ряда, гранулоциты, фибробласты подсчитывали под микроскопом Leica DМ 2500 (Leica, Германия) при об. 100, ок. 10 (масляная иммерсия). Для подсчета клеток использовали 25-узловую сетку (с шагом 10 мкм), вмонтированную в окуляр микроскопа. Учитывали абсолютное количество всех клеток на единице площади гистологического среза, равной 880 мкм², и определяли их относительное содержание (%). Статистический анализ количественного содержания клеток осуществляли с использованием программного обеспечения Statistica 6.0 и Excel. Различия показателей считали значимыми при P≤0,05. Работу с мышами проводили в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.) [11], а также с приказом № 742 Министерства высшего и среднего специального образования СССР «Об утверждении Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» от 13.11.1984 г. Результаты исследования. Анализ клеточного состава СПВ у животных контрольной группы показал, что на исследуемой стандартной площади среза содержится 64±4 клетки. Значительная часть клеток представлена малыми лимфоцитами - 20,1±1,6% или 13±1,5 клетки (рисунок, а). На средние лимфоциты приходятся 5,9±0,7% (3,7±0,4 клетки). Большие лимфоциты, и особенно бласты, в СПВ составляют лишь 0,9±0,4% или 0,53±0,23 - больших лимфоцитов и 0,07±0,06% или 0,07±0,06 - бластов. Обращает на себя внимание весьма высокое содержание плазматических клеток (см. рисунок, а). В сумме плазмобласты и плазмоциты составляют практически половину всех клеток СПВ. Среди них преобладают плазмоциты, которых содержится в 11 раз больше, чем плазмобластов (см. рисунок, а), плазмоцитов -17,6±1,6, плазмобластов -1,7±0,4 клетки. В СПВ наблюдается значительное содержание нейтрофилов (3,0±0,5% или 1,80±0,25 клетки). Эозинофилы (см. рисунок, а) встречаются в 13 раз реже, чем нейтрофилы. Значительную группу в СПВ представляют стромальные клетки (фибробласты, фиброциты, ретикулярные клетки). Они составляют более 1/3 от всех клеток, присутствующих в СПВ (34,3±1,7% или 22,2±2,1 клетки). Среди клеток лимфоидного ряда в СПВ значительное место занимают деструктивно-измененные клетки (4,3±0,6% или 2,7±0,4 клетки). Их цитоплазма находится в состоянии отека, отмечается кариолизис. Несмотря на значительное содержание разрушающихся клеток, доля макрофагов в СПВ относительно небольшая (0,23±0,15%). В СПМК у мышей контрольной группы на стандартной площади среза располагаются 40,5±2,1 клеток. Почти четвертую часть из них составляют малые лимфоциты (см. рисунок, б), их 10,1±1,1 на стандартной площади среза. На долю средних лимфоцитов приходится 2,4±0,4% (1,07±0,20 клетки). Значительно реже между криптами встречаются большие лимфоциты (см. рисунок, б), их насчитывается всего 0,47±0,13 клетки. Бластные формы клеток лимфоидного ряда очень редки (0,12±0,12% или 0,07±0,06 клетки). Нередко обнаруживаются плазмоциты (см. рисунок, б). На стандартной площади среза их 1,27±0,26 клетки. Плазмобласты практически отсутствуют. Гранулоциты, представленные нейтрофилами и эозинофилами, составляют значительную часть клеток СПМК (5,2±0, 9 и 2,2±0,6% или 2,1±0,4 и 0,87±0,23 клетки соответственно). Доминирующими клетками в этой области являются фибробласты, фиброциты, ретикулярные клетки. На их долю приходятся 57,4±1,8% от общего числа клеток (или 23,3±1,2 клетки). Здесь же встречаются клетки, находящиеся в состоянии деструкции (3,3±0,6% или 1,27±0,22 клетки). У мышей контрольной группы в СПМК макрофаги практически отсутствуют. При моделировании условий космического полета (наземный эксперимент) в клеточном составе СПВ происходят изменения. Общее число клеток на стандартной площади среза уменьшается в 1,2 раза (51,6±2,2 клеток), но при этом количество больших и средних лимфоцитов практически сохраняется. Доля малых лимфоцитов увеличивается (см. рисунок, а), их количество 14,1±1,0 клетки). Средних лимфоцитов насчитывается почти в 5 раз меньше, чем малых (5,5±0,9% или 3,0±0,5 клетки). Больших лимфоцитов (см. рисунок, а) на стандартной площади среза - 0,73±0,27, а бластные формы полностью исчезают. Среди плазматических клеток в СПВ преобладают зрелые формы (плазмобластов - 0,27±0,11, плазмоцитов - 8,8±1,2 клетки на стандартной площади среза) (см. рисунок, а). Абсолютное количество и относительное содержание нейтрофилов по сравнению с контролем не меняется. В то же время в СПВ увеличивается доля эозинофилов (см. рисунок, а). Их количество - 1,13±0,23 клетки. Относительное содержание разрушающихся клеток в СПВ увеличивается до 5,6±0,6%, но при этом показатели их абсолютного количества остаются неизменными (эксперимент - 2,80±0,25, контроль - 2,7±0,4 клетки). Макрофаги в СПВ при наземном эксперименте практически полностью исчезают. В СПМК в условиях наземного эксперимента увеличение количества клеток на стандартной площади среза незначимо (42,8±1,2 клетки), количество фибробластов и нейтрофилов - (24,3±0,8 и 2,5±0,5 клетки или 57,1±1,6 и 6,0±1,1% соответственно, эозинофилов 1,47±0,21 клетки или 3,5±0,5%. Относительное содержание клеток, находящихся в состоянии деструкции, составляет 4,4±0,7% или 1,93±0,29 клетки. Абсолютные и относительные показатели количества средних и малых лимфоцитов стабильны (см. рисунок, б). Малых лимфоцитов содержится 24,7±1,2% или 10,7±0,7 клетки, средних лимфоцитов - 2,4±0,4% или 1,07±0,20 клетки. Однако отмечается уменьшение доли больших лимфоцитов (см. рисунок, б). Их количество - 0,13±0,09 клетки на стандартной площади среза, полностью исчезают бластные формы. Среди плазматических клеток при наземном эксперименте встречаются только зрелые формы - плазмоциты (1,5±0,5% или 0,67±0,20 клетки). Обсуждение полученных данных. Сравнительный анализ клеточного состава СПВ и СПМК в контрольной группе мышей показал его отличительные локальные особенности. СПВ содержит в 1,5 раза больше клеток, чем СПМК. Другой особенностью СПВ тощей кишки у мышей контрольной группы является очень высокий показатель количества плазматических клеток, главным образом, плазмоцитов, которые в СПВ обнаруживаются почти в 14 раз чаще, чем между криптами, а их доля среди всех исследованных клеток СПВ в 9 раз выше, чем в СПМК. Присутствие большого количества плазматических клеток в собственной пластинке слизистой оболочки свидетельствует о высоком уровне гуморального иммунитета, особенно в области ворсинок. Вероятнее всего, это явление объясняется близостью начального отдела тощей кишки к двенадцатиперстной кишке, где происходит резкое изменение pH среды, и на первый план выходит антигенное воздействие пищевых масс. В СПВ, по сравнению с областью крипт, содержится также большее количество малых лимфоцитов (в 1,3 раза), но при этом их доля среди остальных клеток оказывается в 1,2 раза меньше, чем в области крипт. В СПВ в 3,4 раза чаще, чем в области крипт, встречаются и средние лимфоциты. Их доля в 1,2 раза больше, что, возможно, связано с процессами трансформации этих клеток в плазмобласты. В контрольной группе мышей в СПВ значительнее выражена деструкция клеток (в 2 раза), чем в собственной пластинке, расположенной между криптами, что, вероятно, объясняется близким контактом ворсинок с химусом и активацией процессов всасывания. У мышей контрольной группы СПМК отличается от СПВ более высоким содержанием гранулоцитов, абсолютное количество нейтрофилов в 1,15 раза, эозинофилов в 6,7 раза, относительное содержание нейтрофилов в 1,7, а эозинофилов в 9,5 раза больше, чем в СПВ. Между криптами у мышей, находящихся при виварном содержании, отмечается более высокая доля (в 1,7 раза) клеток стромы (фибробластов, фиброцитов, ретикулярных). Сопоставление строения начального отдела стенки тощей кишки у экспериментальных и контрольных мышей не выявило существенных различий, что согласуется с данными других исследователей [6]. Однако детальный анализ клеточного состава собственной пластинки слизистой оболочки тощей кишки показал существенные изменения содержания ряда клеток, происходящие в процессе моделирования условий космического полета животных. При наземном эксперименте, имитирующем полет животных в космосе, в СПВ отмечается некоторое уменьшение общего содержания клеток (в 1,2 раза), что совпадает с данными, полученными при исследовании двенадцатиперстной кишки в экспериментах с гипокинезией [3]. Наше исследование показало, что в СПВ при наземном эксперименте изменений количества лимфоцитов (бластов, больших, средних и малых), а также разрушающихся клеток (в отличие от такового при гипокинезии) не происходит. Доли больших и малых лимфоцитов несколько увеличиваются (в 1,6 и 1,4 раза соответственно). На фоне общей сохранности числа лимфоцитов в СПВ обращает на себя внимание резкое уменьшение плазматических клеток (в 2,1 раза в абсолютных цифрах и в 1,8 раза - относительного содержания). Данные литературы свидетельствуют, что эксперименты с 30-суточной гипокинезией у крыс также приводят к значительному снижению в ворсинках двенадцатиперстной кишки доли (в 8,5 раза) плазматических клеток [3]. Возможно, что в наземных экспериментах с созданием условий космического полета, когда животные находятся в условиях капсул, изменения количества плазматических клеток в собственной пластинке слизистой оболочки тонкой кишки в какой-то степени связаны и с ограничением их подвижности. Однако основной причиной уменьшения числа этих клеток все же, видимо, является торможение процессов трансформации лимфоцитов. Аналогичные картины были отмечены у космонавтов после их приземления, связанные с замедлением (или прекращением) процессов бластогенеза [9, 13]. Не исключено, что усиление моторики тощей кишки, имеющей место при моделировании условий невесомости [2], также может оказывать влияние на содержание плазматических клеток в СПВ. Добавление в состав корма экспериментальных животных белка казеина, обладающего аллергенными свойствами [12], может служить причиной увеличения числа эозинофилов как в СПВ (в 8,7 раза абсолютного количества и в 10,4 раза относительного содержания), так и в собственной пластинке слизистой оболочки между криптами кишки. Проведенные нами исследования показали, что создание наземных условий космического полета не влияет на количество нейтрофилов, расположенных в собственной пластинке слизистой оболочки кишки. Тем не менее, данные литературы свидетельствуют, что в крови у людей при наземном эксперименте активность нейтрофилов снижается [9]. Пребывание животных в блоках «БИОС-МЛЖ» приводит к небольшому, но значимому уменьшению в СПВ числа клеток стромы (в 1,16 раза). При этом относительное содержание этих клеток во столько же раз увеличивается. В СПМК в условиях наземного эксперимента изменений числа средних и малых лимфоцитов, а также клеток стромы не происходит. Однако в 3,8 раза уменьшается доля и в 3,6 раза абсолютное количество больших лимфоцитов, что также свидетельствует в пользу замедления процессов трансформации лимфоцитов. В области крипт, как и в СПВ, отмечается рост числа эозинофилов (в 1,6 раза относительного содержания и в 1,7 раза абсолютного количества). Увеличивается количество разрушающихся клеток. Полученные данные об изменениях клеточного состава собственной пластинки слизистой оболочки тощей кишки у мышей при наземном эксперименте, имитирующем условия космического полета, свидетельствуют о снижении местного гуморального иммунитета в стенке органа, что может явиться причиной развития инфекционных процессов [8-10]. Итак, анализ клеточного состава СПВ и СПМК тощей кишки у мышей С57/BL6 позволяет высказать предположение, что количественные изменения клеток при наземном эксперименте обусловлены не только ограничением подвижности животных, но также связаны с составом, консистенцией и консервацией получаемого ими корма. При этом более чувствительными структурами кишки являются ворсинки, в которых в значительном количестве исчезают плазмоциты. При этом в исследованных зонах кишки отмечается увеличение числа эозинофилов, что может расцениваться как проявление аллергической реакции.

作者简介

G. Aminova

RAS Research Institute of Human Morphology

Email: lab-funkanat@yandex.ru
Laboratory of Functional Anatomy

M. Sapin

RAS Research Institute of Human Morphology

Laboratory of Functional Anatomy

L. Yerofeyeva

RAS Research Institute of Human Morphology

Laboratory of Functional Anatomy

参考

补充文件