THE PROCESSES OF CELL PROLIFERATION, APOPTOSIS AND ANGIOGENESIS IN PATHOLOGICALLY UNCHANGED LUNG AND IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER



Cite item

Full Text

Abstract

The objective of this study was to examine cell proliferation, apoptosis and angiogenesis in pathologically unchanged lung and in non-small cell lung cancer with the use of appropriate markers. The material studied included samples of pathologically unchanged lung (n=80) and those obtained at operations in 237 cases of non-small cell lung cancer. Immunohistochemical methods were used to demonstrate Ki-67, topoisomerase IIα (ТороIIα), p53, bcl-2, bax, CD34 and podoplanin. Argyrophilic proteins associated with nucleolar organizer regions (Ag-NOR proteins), were detected by impregnation with silver nitrate. The quantitative data were obtained and the peculiarities of the expression of markers associated with proliferation, apoptosis and angiogenesis in pathologically unchanged lung were determined. In the alveoli, the labeling index of Ki-67 and ТороIIα was less than 1%, AgNOR area index was equal to 1.31±0.20; p53, bcl-2, bax expression was absent, density of blood vessels was equal to 86 (73-102), while lymphatic vessels were absent. In the bronchus, the labeling index of Ki-67 and ТороIIα were respectively 4 (1-8) and less than 1%, AgNOR area index - 1.85±0.24, bax expression - 100%, density of blood and lymph vessels -22 (17-31) and 4 (2-7) respectively; p53 and bcl-2 expression were absent. The results were compared with the expression of markers in non-small cell lung cancer. This comparison has fundamental and differential diagnostic value in the study of histopathological lung material. The expression of markers associated with proliferation, apoptosis and angiogenesis changes from pathologically unchanged lung to non-small cell lung cancer.

Full Text

Процессы пролиферации и апоптоза (запро-G1-, S-, G2-, М-фазы, однако функциональное граммированной гибели клетки) являются ключе-значение этого ядерного белка в процессе проливыми в развитии тканевых структур легкого и их ферации не совсем ясно. Фермент топоизомераза последующем функционировании. IIα (ТороIIα) - белок с ферментативной актив На сегодняшний день существуют определен-ностью, участвующий в топологической сборные трудности в достоверной оценке пролифера-ке ДНК во время транскрипции, конденсации и тивного потенциала от неизмененного эпителия сегрегации хромосом, выявляется в клетках, нахобронхов и альвеол до опухоли, так как процесс дящихся в S-, G2-, M-фазах клеточного цикла, пролиферации отражает не только количество в связи с чем является также маркером пролипролиферирующих клеток (пролиферативная феративной активности [1, 3]. Аргирофильные активность, фракция роста), но и скорость про-белки, ассоциированные с ядрышкообразующими хождения клеткой фаз митоза (продолжитель-районами (Ag-ЯОР-белки), являются маркерами ность клеточного цикла). Для оценки пролифе-скорости клеточного цикла и широко используративной активности общепризнанным и доступ-ются в гистопатологии [2, 4-6, 8]. До 75% окраным является иммуногистохимическое опреде-шивания Ag-ЯОР-белков составляют 2 главных ление содержания антигена Ki-67 [3, 8-10, 12]. аргирофильных белка С23 (нуклеолин) иВ23 Антиген Ki-67 выявляется в клетках в позднюю (нуклеофозмин), играющих важнейшую роль в синтезе рибосомальной РНК [7]. Эти белки выявляются в ядрах клеток во все фазы клеточного цикла, количественно увеличиваясь в 1,5-3 раза в S-и G2-фазах. Показана обратная зависимость между количественным содержанием Ag-ЯОРбелков и длительностью клеточного цикла, временем удвоения опухоли. В настоящее время процесс апоптоза активно изучается на стадийных этапах канцерогенеза от нормы и до рака легкого [3, 13-15]. Белок р53 является транскрипционным фактором, регулирующим функцию большинства генов и выполняющим супрессорную функцию (остановка клеточного цикла, репарация ДНК и апоптоз). Bcl-2 является антиапоптотическим белком, а bax - проапоптотическим белком митохондриального пути активации апоптоза. Активация bax происходит через белок р53, а инактивация - через димеризацию с белком bcl-2. Мелкие кровеносные и лимфатические сосуды, на стандартных гистологических препаратах не дифференцируются. Антиген CD34 является маркером эндотелиоцитов кровеносных сосудов, антиген подопланин - маркером эндотелиоцитов лимфатических сосудов. Иммуногистохимическое выявление данных антигенов на микроскопическом светооптическом уровне позволяет оценивать разные стороны ангиогенеза в патологически неизмененном легком - гемангиогенез и лимфангиогенез [9, 11, 12]. При анализе зарубежной и отечественной литературы мы не нашли исследований, посвященных комплексному изучению процессов пролиферации, апоптоза и ангиогенеза в патологически неизмененном легком, а также в сопоставлении с его немелкоклеточным раком (НМКР). Цель настоящей работы - исследование процессов пролиферации (на основании изучения Ki-67, ТороIIαи Ag-ЯОР-белков), апоптоза (на основании изучения p53, bcl-2 и bax) и ангиогенеза (на основании изучения CD34 и подопланина) в патологически неизмененном легком и с его НМКР. Материал и методы. Исследован операционный материал легких с его НМКР (n=237), удаленных за период 2007-2009 гг. в Алтайском краевом онкологическом диспансере (109 случаев аденокарциномы и 128 случаев плоскоклеточного рака). Изучено 80 патологически неизмененных участков легкого из отдаленных от опухоли мест операционного материала. Материал фиксировали 18-24 чв 10% нейтральном забуференном формалине. После стандартной проводки готовили гистологические срезы толщиной 4 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином-эозином, использовали ШИКреакцию и окраску альциановым синим, по Крейбергу. Иммуногистохимическим методом выявляли на Ki-67 (клон MIB-1, Dako, США), ТороIIα (клон JS5B4, Ventana, США), р53 (клон DO-7, Dako, США), bcl-2 (клон 124, Dako, США), bax (клон SP47, SpringBio, США), CD34 (клон QBEnd/10, Ventana, США), подопланин (клон D2-40, Ventana, США) в автостейнере Ventana XT (США). В каждом случае при исследовании Ki-67, TopoIIα, р53, bcl-2, bax исследовали 1000 клеток в 5-7 полях зрения при ув. 400. Определяли индекс метки (ИМ) - долю положительно окрашенных клеток от общего количества подсчитанных клеток в процентах (для Ki-67, ТороIIα, р53 - ядерное окрашивание, для bcl2, bax - цитоплазматическое). ИМ р53, bcl2 и bax более 10% считали положительной экспрессией антигена. В каждом случае при исследовании СD34 и подопланина исследовали 3 поля зрения при ув. 200 и вычисляли соответственно плотность микроциркуляторного русла кровеносных сосудов (ПМЦР-Г) или лимфатических сосудов (ПМЦР-Л) - среднее значение количества сосудов с позитивно окрашенным эндотелием; подсчитывали отдельно расположенные сосуды с определяемым просветом и без просвета (кластеры позитивно окрашенных клеток). Для изучения Ag-ЯОР-белков проводили импрегнацию срезов нитратом серебра по одностадийной методике. Перед импрегнацией срезы автоклавировали при 120 ˚С 20 мин, в 0,01 М цитратном буфере (рН=6,0). Определяли площадь Ag-ЯОР-белков (в мкм2) в ядрах 100-120 клеток с 10-15 цифровыми изображениями, полученными при увеличении микроскопа 1000 (об. 100, 1,25, масляная иммерсия). Компьютерный анализ изображений проводили с помощью программы ImageJ 1.42. В качестве внутреннего контроля окрашивания использовали площадь Ag-ЯОР-белков в ядрах малых лимфоцитов. Находили индекс площади (ИП) Ag-ЯОР-белков - частное от деления площадей Ag-ЯОРбелков в клетке опухоли и малом лимфоците. Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью программы Statistica 6.0. Так как распределение ИП Ag-ЯОР-белков было параметрическим, то данные представляли в виде среднего и стандартного отклонения. Поскольку распределение ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, ПМЦР-Г и ПМЦР-Л было непараметрическим, то данные представляли в виде медианы и интерквартильного интервала. Данные о положительной экспрессии маркеров, связанных с апоптозом (р53, bcl2 и bax), были бинарными, их представляли в виде абсолютного и относительного (в процентах) количества. Применяли непараметрические методы: однофакторный тест Краскела-Уоллиса, U-тест Манна-Уитни, двусторонний критерий Фишера, коэффициент корреляции рангов Спирмена (r). Различия считали значимыми при Р<0,05. Результаты исследования. Результат иммуногистохимической реакции определяли по окрашиванию ядер (Ki-67, ТороIIαир53) или цитоплазмы (bcl-2 и bax) эпителиоцитов, а также эндотелиоцитов кровеносных (CD34) и лимфатических (подопланин) сосудов, от светло-до темно-коричневого цвета. Результат импрегнации нитратом серебра определяли по округлым гранулам черного цвета (Ag-ЯОР-белки), расположенным на фоне коричневого ядрышка или бледножелтого ядра (рисунок). В ядрах малых лимфоцитов чаще определялась одна гранула серебра, реже две. Средняя площадь Ag-ЯОР-белков в ядре малого лимфоцита равнялась 1,48 (0,12) мкм2. Результаты исследования маркеров, связанных с пролиферацией (Ki-67, ТороIIαи Ag-ЯОР-белки), апоптозом (p53, bcl-2 и bax) и ангиогенезом (CD34 и подопланин), в патологически неизмененном легком и с его НМКР представлены в таблице. В ядрах клеток патологически неизмененного эпителия альвеол ИМ Ki-67 и ТороIIα составил менее 1% (единичные положительные клетки), ИП Ag-ЯОР-белков - 1,31±0,20. В эпителии бронхов ИМ Ki-67 составил, в среднем, 4 (1-8), ИМ ТороIIα - менее 1% (единичные положительные клетки), ИП Ag-ЯОР-белков - 1,85±0,24. В клетках НМКР легкого ИМ Ki-67 составил 25 (18-42), ИМ ТороIIα - 19 (12-27) и ИП Ag-ЯОРбелков - 6,52±1,66 (см. рисунок, в). В клетках НМКР наблюдалось повышение ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα и ИП Ag-ЯОР-белков по сравнению с таковым в патологически неизмененном эпителии альвеол и бронхов (Р<0,001). Обнаружена взаимосвязь экспрессии Ki-67, ТороIIαи Ag-ЯОРбелков с гистогенезом НМКР легкого - выше при плоскоклеточном раке, чем при аденокарциноме. Отмечена корреляция (Р<0,001) между маркерами, связанными с пролиферацией - ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα и ИП Ag-ЯОР-белков. В ядрах клеток патологически неизмененного эпителия альвеол экспрессия p53, bcl-2 и bax не была обнаружена. В эпителии бронхов отсутствовали p53-положительные клетки, а bcl2-положительные клетки определялись только в базальном слое (ИМ bcl-2 - менее 10%), baxположительные клетки имелись во всех слоях эпителия (ИМ bax - более 90%). При НМКР легкого положительная экспрессия p53 была обнаружена в 104 (44%) случаях, bcl-2 - в 43 (18%) и bax - в 130 (55%) случаях (см. рисунок, а, б). В клетках НМКР легкого наблюдалось снижение экспрессии bax (по сравнению с таковой в эпителии бронхов) и повышение экспрессии p53 и bcl-2 по сравнению с экспрессией в патологически неизмененном эпителии альвеол и бронхов (р<0,001). Обнаружена взаимосвязь экспрессии р53, bcl-2 и bax с гистогенезом НМКР легкого: экспрессия bcl-2 ир53 была выше при плоскоклеточном раке, а bax - выше при аденокарциноме. Отсутствовала корреляция между маркерами, связанными с апоптозом - ИМ р53, ИМ bcl-2 и ИМ bax. Обнаружена корреляция (Р˂0,05) между маркерами, связанными с пролиферацией и апоптозом: между ИП Ag-ЯОР-белков и р53, bcl-2; между ИМ Ki-67 ир53, bax; между ИМ ТороIIα ир53, bax. В патологически неизмененных альвеолах ПМЦР-Г составила 86 (73-102). Лимфатические сосуды в межальвеолярной перегородке отсутствовали и определялись в межальвеолярной соединительной ткани, около кровеносных сосудов, вне состава микроциркуляторного русла. В патологически неизмененных бронхах ПМЦР-Г составила 22 (17-31), ПМЦР-Л - 4 (2-7). При НМКР легкого ПМЦР-Г составила 43 (34-60), ПМЦР-Л - 4 (2-9) (см. рисунок, г, д). В НМКР легкого наблюдалось снижение ПМЦР-Г по сравнению с таковой в альвеолах и повышение - в бронхах (Р<0,001), а также повышение ПМЦР-Л по сравнению с таковой в альвеолах (Р<0,001) и отсутствие различия - в бронхах. Отсутствовала корреляция между маркерами, связанными с ангиогенезом - ПМЦР-Г и ПМЦР-Л, и маркеров, связанных с ангиогенезом (ПМЦР-Г и ПМЦР-Л) и пролиферацией (ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα и ИП Ag-ЯОР-белков), с одной стороны, а также с апоптозом (р53, bcl-2 и bax) - с другой стороны. Обсуждение полученных данных. В патологически неизмененном легком уровень пролиферации низкий. Так, в эпителии альвеол отмечаются небольшое количество пролиферирующих клеток (ИМ Ki-67 и ТороIIα) и низкая активность ядрышковых организаторов (ИП Ag-ЯОР-белков), которая близка к активности ядрышковых организаторов малого (неактивного) лимфоцита. В эпителии бронхов количество Ki-67 положительных клеток несколько больше, чем в эпителии альвеол, а количество ТороIIαположительных клеток сопоставимо с таковым в эпителии альвеолы. Это указывает на более высокую пролиферативную активность эпителия бронхов, чем эпителия альвеол. Активность ядрышковых организаторов в эпителиоцитах бронхов также больше, чем в эпителии альвеол, и почти в 2 раза больше, чем в малом лимфоците. Результаты нашего исследования, установившего низкую пролиферативную активность патологически неизмененного эпителия бронхов, совпадают с данными K. Hiroshima и соавт. [12], использовавших Ki-67. В предыдущих исследованиях нами было показано [1], что патологически неизмененная ткань также характеризуется крайне низкой пролиферативной активностью, оцененной по ИМ ТороIIα. При исследовании эпителиев желудка [4], толстой кишки [5] и гладкой мышечной ткани матки [2] было выявлено, что активность ядрышковых организаторов имеет отличие в зависимости от уровня пролиферации клеток неизмененной ткани - она выше в пролиферативном компартменте по сравнению с компартментом дифференцированных клеток. В патологически неизмененном эпителии альвеол не определялась экспрессия маркеров, связанных с апоптозом (p53, bcl-2 и bax). В патологически неизмененном эпителии бронхов отсутствовала экспрессия р53, что согласуется с результатами исследований других авторов [11-15]. Связано это с тем, что период полужизни немутантного белка р53 крайне короткий, и его иммуногистохимическая визуализация в неизмененных тканях затруднена. По результатам нашего исследования, а также данным других авторов [13-15] экспрессия bcl-2 определяется в базальных клетках патологически неизмененного эпителия бронхов. Являясь антиапоптотическим белком, bcl-2 предотвращает гибель недифференцированных базальных клеток бронхов. Экспрессия bax была обнаружена во всех эпителиоцитах бронхов, таким образом, определяя вероятность апоптоза дифференцированных бронхиальных эпителиоцитов. Наши сведения об экспрессии bax в этом эпителии также соответствуют данным мировой литературы [14, 15]. Однако реализация процесса апоптоза является следствием соотношения большого количества про-и антиапоптотических факторов, а не активности одного белка. Вокруг альвеол выявлена высокая плотность расположения кровеносных сосудов и не обнаружены лимфатические сосуды, что связано с наличием газотранспортной функции и отсутствием лимфатической дренажной функции альвеол. Около бронхов плотность расположения кровеносных сосудов меньше, чем между альвеолами, и присутствуют лимфатические сосуды, обеспечивая трофическую и дренажную функцию. Количественные данные о плотности расположения кровеносных сосудов вокруг бронхов, полученные в настоящем исследовании на операционном материале, коррелируют с данными исследований материала бронхобиопсий других авторов [9, 11, 12]. Результаты нашего исследования и данные мировой литературы показали, что при НМКР легкого по сравнению с патологически неизмененным эпителием альвеолы и бронха увеличивается экспрессия маркеров, связанных с пролиферацией (Ki-67, ТороIIαи Ag-ЯОР-белки) [3, 8-10], апоптозом (p53 и bcl-2) [3, 10, 14, 15], и уменьшается экспрессия bax [14, 15], что приводит к повышенному воспроизводству опухолевых клеток, нарушению процессов клеточной гибели и выживанию раковых клеток. Экспрессия маркеров, связанных с пролиферацией, апоптозом и ангиогенезом, взаимосвязана с гистогенетическими вариантами НМКР легкого [3, 10]. Вероятно, особенности генетических изменений, характерные для определенного гистогенетического варианта НМКР легкого, определяют фундаментальные биологические процессы - пролиферацию, апоптоз и ангиогенез. Таким образом, получены количественные данные об экспрессии маркеров, связанных с пролиферацией (Ki-67, ТороIIαи Ag-ЯОР-белки), апоптозом (p53, bcl-2 и bax) и ангиогенезом (CD34 и подопланин) в патологически неизмененном легком (альвеола и бронх). Определены различия в экспрессии маркеров, связанных с пролиферацией, апоптозом и ангиогенезом при НМКР легкого по сравнению с нормой, а также при аденокарциноме по сравнению с плоскоклеточным раком легкого, что имеет дифференциально-диагностическое значение при исследовании патогистологического материала из легкого.
×

About the authors

D. S. Kobyakov

Kogalym City Hospital

Email: dskob@yandex.ru
Department of Pathology

A. M. Avdalyan

Altai Branch of RAS N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Email: ashot_avdalyan@mail.ru
Laboratory of Molecular Diagnostics

A. F. Lazarev

Altai Branch of RAS N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Laboratory of Molecular Diagnostics

Ye. L. Lushnikova

RAS Siberian Branch Research Institute of Regional Pathology and Pathomorphology

Laboratory of General Pathology, Department of General Pathology and Morbid Anatomy

L. M. Nepomnyashikh

RAS Siberian Branch Research Institute of Regional Pathology and Pathomorphology

Laboratory of General Pathology, Department of General Pathology and Morbid Anatomy

References

  1. Авдалян А. М., Бобров И. П., Климачев В. В., Лазарев А. Ф. Активность Topoisomerase IIα и уровень пролиферативной активности по степени бромдезоксиуридиновой (Brdu) метки в лейомиосаркоме тела матки // Арх. пат. 2011. Т. 73, № 1. С. 24-29.
  2. Бобpов И. П., Авдалян A. M., Лазаpев A.Ф. и др. Морфофункциональная характеристика белков областей ядрышковых организаторов при гладкомышечных опухолях матки // Арх. пат. 2008. Т. 70, № 3. С. 18-23.
  3. Коган Е. А., Швец С. И., Коваленко В. Л., Соболева Ю. В. Соотношение процессов пролиферации, апоптоза, ангиогенеза и метастазирования в различных гистогенетических типах рака легкого (иммуногистохимическое исследование) // Арх. пат. 2004. Т. 66, № 6. С. 33-38.
  4. Лазарев А. Ф., Бобров И. П., Климачев В. В., Лубенников В. А. Характеристика ядрышкового аппарата опухолевых клеток при раке желудка // Арх. пат. 2002. Т. 64, № 6. С. 30-32.
  5. Лазарев А. Ф., Кобяков Д. С., Климачев В. В. и др. Аргирофильные белки районов ядрышковых организаторов в аденомах с различной степенью дисплазии и аденокарциноме толстой кишки // Арх. пат. 2010. Т. 72, № 4. С. 16-20.
  6. Мамаев H. H., Гиндина Т. Л., Скороход И. А. и др. Количественная характеристика гемопоэза у больных множественной миеломой по данным серебрения ядрышек // Гематол. и трансфузиол. 2002. Т. 47, № 4. С. 24-27.
  7. Мамаев Н. Н., Мамаева С. Е. Структура и функция ядрышкообразующих районов хромосом: молекулярные, цитологические и клинические аспекты // Цитология. 1992. Т. 34, № 10. С. 3-25.
  8. Райхлин Н. Т., Букаева И. А., Смирнова Е. А. и др. Значение экспрессии ядрышковых аргирофильных белков и антигена Ki-67 в определении пролиферативной активности клеток и прогноза «малого» (Т1) рака легкого // Арх. пат. 2008. Т. 70, № 3. С. 15-18.
  9. Cavarga I., Kocan P., Boor A. et al. Immunohistochemical markers of proliferation and vascularisation in preneoplastic bronchial lesions and invasive non-small cell lung cancer // Neoplasma. 2009. Vol. 56, № 5. Р. 414-421.
  10. D’Amico T.A., Aloia T.A., Moore M. B. H. et al. Molecular Biologic Substaging of Stage I Lung Cancer According to Gender and Histology // Ann. Thorac. Surg. 2000. Vol. 69, № 6. Р. 882-886.
  11. Fontanini G., Calcinai A., Boldrini L. et al. Modulation of neoangiogenesis in bronchial preneoplastic lesions // Oncol. Rep. 1999. Vol. 6, № 4. P. 813-817.
  12. Hiroshima K., Iyoda A., Shibuya K. et al. Evidence of neoangiogenesis and an increase in the number of proliferating cells within the bronchial epithelium of smokers // Cancer. 2002. Vol. 95, № 7. Р. 1539-1545.
  13. Jeanmart M., Lantuejoul S., Fievet F. et al. Value of immunohistochemical markers in preinvasive bronchial lesions in risk assessment of lung cancer // Clin. Cancer Res. 2003. Vol. 9, № 6. Р. 2195-2203.
  14. Porebska I., Wyrodek E., Kosacka M. et al. Apoptotic markers p53, Bcl-2 and Bax in primary lung cancer // In Vivo. 2006. Vol. 20, № 5. Р. 599-604.
  15. Tormanen U., Nuorva K., Soini Y., Paakko P. Apoptotic activity is increased in parallel with the metaplasia-dysplasia-carcinoma sequence of the bronchial epithelium // Br. J. Cancer. 1999. Vol. 79, № 5-6. P. 996-1002.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2015 Eco-Vector


Периодический печатный журнал зарегистрирован как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): № 0110212 от 08.02.1993.
Сетевое издание зарегистрировано как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): ЭЛ № ФС 77 - 84733 от 10.02.2023.